1、小鼠肾发育中 Calbindin-D28k 的定量分析【摘要】 目的 观察 Calbindin-D28k 在小鼠肾发生发育中的表达规律。方法 应用蛋白印迹技术对各组小鼠肾 Calbindin-D28k 的表达进行定量检测。结果 胚龄 12 d Calbindin-D28k 表达量极低；胚龄 14 d 到胚龄 16 d 表达量增加；胚龄 16 d 到胚龄 18 d 表达量无显著性变化；胚龄 18 d 到生后 7 d 表达量明显增加；生后 7 d 到生后 14 d，Calbindin-D28k 表达量减少。生后 14 d 到生后 40 d，Calbindin-D28k 表达量无显著性差异。结论 从
2、胚龄 12 d 到生后 7 d 期间 Calbindin-D28k 表达的逐渐增强与小鼠肾钙离子转运能力的完善可能有一定的关系。 【关键词】 Calbindin-D28k 小鼠 肾发育Abstract：Objective To observe the expression rules of Calbindin-D28k during renal development of mouse. Methods Western blotting technique was used to measure the protein content of Calbindin-D28k at differen
3、t development stages of embryonic and postnatal mice. Results At E12, Calbindin-D28k expression could be hardly detected in the kidney. From E14 to E16, the expression was increased. There was no significant difference from E16 to E18. From E18 to N7, the expression of Calbindin-D28k was increased o
4、bviously. From N7 to N14, the expression of Calbindin-D28k was decreased. There was no significant difference between N14 and 40. Conclusions The expression of Calbindin-D28k is weak at E12, and is enhanced with ages to the peak at N7, and decreased thereafter. Calbindin-D28k is a calcium ferry prot
5、ein in cytoplasm and is very important to renal calcium reabsorption during the development of kidney.Key words：Calbindin-D28k; mouse; renal developmentCalbindin-D28k 最初是由 Wasserman 和 Taylor1于 1966 年在鸡小肠粘膜中发现的，其分子量约为 27.8103，由于在小肠中的合成受1,25-二羟基维生素 D3 水平的调节,故又被称为维生素 D 依赖性钙结合蛋白（Vitamin D-dependent calc
6、ium binding protein，CaBP） 2 。Calbindin-D28k 与肾发育关系的研究国外曾见报道3，4 ，但关于小鼠肾发育中 Calbindin-D28k 表达的定量研究国内尚未见报道。本实验通过蛋白印迹（Western blotting）技术定量检测小鼠肾发育过程中Calbindin-D28k 的表达规律，探讨其与小鼠肾发育之间的关系。1 材料和方法1.1 实验动物2530 g 成年健康昆明小白鼠，由辽宁医学院实验动物中心提供医动字第 SCXY(辽)2003-2007 号 。1.2 实验试剂Calbindin-D28k 单克隆抗体由武汉博士德生物工程有限公司提供;PVD
7、F 膜、SDS、NBT/BCIP、Tween-20、NP-40、PMSF 等由 SIGMA 公司提供。1.3 标本制备选用成年健康昆明小白鼠，按雌雄比例 11 同窝饲养，以阴道栓脱落的最早时间计为胚龄（E）0 d5 。孕鼠分笼饲养，每日早 800、晚 500 观察生产情况，以仔鼠出生的最早时间计为生后（N）0 d。分别取 E10、12、14、16、18 d 胎鼠和 N1、3、7、14、21、40 d 仔鼠，每组 8 只，每只母鼠取 2 只胎鼠或仔鼠。1.4 Western blotting 定量检测 Calbindin-D28k各组小鼠取右肾，入液氮迅速冷冻，-85 冰箱保存待用。取冷冻待用的
8、右肾组织，置于 12 mL 匀浆器中，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎，加入 4 倍体积的裂解液(50 mM Tris-HCl,，pH 8.0 150 mM NaCl，100 g/mL PMSF，1% TritonX-100) 0 下匀浆、冰上裂解 30 min，冷冻离心机(12 000 r/min) 4 ，20 min 离心去除细胞碎片，取上清液，用考马斯亮兰法测定总蛋白含量。每个样品取 25 g 与 5十二烷基硫酸钠（SDS）上样缓冲液混合，煮沸 5 min，100 g/L 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转硝酸纤维素膜。5%脱脂奶粉室温封闭 1 h，加入一抗-Calbindin-D28k
9、 单克隆抗体(稀释度为 1400)，二抗-生物素化山羊抗小鼠 IgG（稀释度为 1700 )， NBT/BCIP 试剂显色，扫描电泳条带 ，用 Gene Tools 软件分析电泳条带净吸光度值。1.5 统计学分析应用 SPSS 12.0 统计软件包对实验数据进行统计学分析，数据以s 表示，采用单因素方差分析检验，P0.05 认为有统计学意义。2 结果各胚（日）龄小鼠肾 Calbindin-D28k 表达量电泳结果见图 1，净吸光度值见表 1、图 2。胚龄 12 d，Calbindin-D28k 表达量极低，无法检测。胚龄 14 d 到胚龄 16 d，Calbindin-D28k 表达量增加，差
10、异有显著性意义（12.09940.6911） ， （13.23830.1729） ，P0.01 。 胚龄 16 d 到胚龄 18 d，Calbindin-D28k 表达量无明显变化(P0.05)。胚龄 18 d 到生后 7 d，Calbindin-D28k 表达量明显增加，差异有显著性意义（13.84470.2385） ， （15.27180.2019） ， （16.32080.2839） ，（19.33830.4044） ，P0.01 。生后 7 d 到生后 14 d，Calbindin-D28k 表达量减少，差异有显著性意义（19.33830.4044） ，（15.89151.0185）
11、，P0.01 。生后 14 d 到生后 40 d，Calbindin-D28k 表达量无显著变化(P0.05)。表 1 各胚（日）龄小鼠肾Calbindin-D28k 表达量（略）注：aP0.01，与前一胚（日）龄比较有显示性差异3 讨 论Calbindin-D28k 是一种细胞内与钙高亲和力蛋白，存在于与钙转运密切相关的组织中。从系统发育的角度看，Calbindin-D28k 是一个古老的大分子，在进化早期，它仅是一个神经蛋白，随着向更高的种族发育，它才被存留于其他组织中，如肾脏、肠道和胎盘6 。在肾脏，Calbindin-D28k 定位于远端肾单位的远曲小管、连接小管、皮质集合管7 。在前
12、期研究中，我们应用免疫组织化学技术结合图象分析方法发现 Calbindin-D28k 在胚龄 12 d 小鼠胎鼠输尿管芽上皮细胞胞浆内可见微弱的表达。胚龄 16 d Calbindin-D28k 在输尿管芽壶腹可被明显的观察到，并且随着肾单位发育即 S 小体的出现，在 S 小体与输尿管芽壶腹之间的连接小管也出现微弱表达。随着肾发育，Calbindin-D28k 的表达逐渐增强，最终定位于小鼠肾远曲小管、连接小管和皮质集合管。本实验进一步采用蛋白印迹技术对 Calbindin-D28k 表达进行定量分析，发现 Calbindin-D28k 从胚龄 12 d 的胎鼠开始表达到生后 7 d 的小鼠其
13、表达量逐渐增加，而从生后 7 d 到生后 40 d 的小鼠，阳性表达稍减少并趋于平稳，没有显著性的变化。推测从胚龄 12 d 到生后 7 d 期间 Calbindin-D28k 表达的逐渐增强与小鼠肾钙离子转运能力的完善有一定的关系。关于 Calbindin-D28k 的生理功能，学者们提出了几种理论：载体学说认为Calbindin-D28k 作为一种运输蛋白，可与钙离子结合并参与细胞内钙的转运过程。缓冲理论认为 Calbindin-D28k 可能是细胞内钙缓冲剂，通过与钙离子结合来保持细胞内钙的平衡，防止达到中毒剂量，以保持组织细胞的正常发育。活化剂理论认为 Calbindin-D28k 增
14、加了管壁膜钙通道的活性，或 Ca2+-Mg2+-ATP 酶的活力 ，因而增加了钙的重吸收8 。总之，对 Calbindin-D28k 在肾表达的相关研究，将有助于增进对肾发生发育的认识，有利于阐明 Calbindin-D28k 在肾钙转运中的作用，从而为临床肾钙平衡失调的研究提供基本的实验数据。【参考文献】1Wasserman RH, Taylor AN. Vitamin D3-induced calcium-binding protein in chick intestinal tissueJ. Science, 1966,15:791-796.2毛萌, 王道聪VD 及 CaBP-Ds 在肠
15、道和肾脏钙转运中的作用J 国外医学:儿科学分册，1996，23(6):289-291.3Sandulache D, Grahammer F, Artunc F. Renal Ca2+ handling in sgk1 knockout miceJ. Pflugers Arch, 2006, 452(4):444-452.4Takeuchi K. Molecular mechanism in biological transport in the kidney: Calcium transporters (Na+/Ca2+exchanger, calcium binding proteins,
16、Ca channels, Ca-ATPase) J. Nippon Rinsho, 2006,64(2):150-152.5Timpl R, Rohde H, Robey PG,et al. Laminin-a glycolprotein from basement membranesJ. Biol Chem,1979,254(19):9933-9937.6毛萌.钙元素在肠道的吸收过程J.中国临床医学,2001,29(2):2-3.7Liu L, Khastgir A, McCauley JM, et al. RT-PCR microlocalization of mRNAs for Calbindin-D28k and vitamin D receptor in the murine nephronJ. Am J Physiol, 1996 ,270(4):677-681.8Hemmingsen C. Regulation of renal Calbindin-D28kJ. Pharmacol Toxicol ,2000,87 (3):5-30.
