1、小鼠基质金属蛋白酶9 RNA 干扰慢病毒载体在体外的沉默效应【摘要】 目的 探讨构建的小鼠基质金属蛋白酶(MMP)9 RNA 干扰(RNAi)慢病毒载体在体外工具细胞中的沉默效应。方法 针对小鼠MMP9 基因序列构建的 MMP9 过表达克隆质粒和 RNAi 慢病毒载体共转染培养良好的工具细胞(293T 和 NIH3T3 细胞)，采用实时荧光定量 PCR和 Western 印迹观察 RNAi 对工具细胞中 MMP9 mRNA 和蛋白表达的下调作用。结果 构建的 MMP9 RNAi 慢病毒载体能显著降低工具细胞中MMP9 表达量。结论 成功构建了能够抑制小鼠 MMP9 表达的 RNAi 慢病毒载体
2、，为在体研究奠定了基础。 【关键词】 基质金属蛋白酶9;RNA 干扰;慢病毒载体【Abstract】 Objective To explore the silencing effect of the constructed mices matrix metalloproteinase (MMP)9 RNA interference (RNAi) lentivirus vector in vitro. Methods 293T and NIH3T3 cells were cocultured by MMP9 overexpressed clone plasmid and RNAi lentivi
3、rus vector. Real time PCR and Western blot were adopted to observe the downregulation of MMP9 mRNA expression in 293T and NIH3T3 cells by RNAi. Results The constructed MMP9 RNAi lentivirus vector significantly decreased MMP9 expression in 293T and NIH3T3 cells. Conclusions RNAi lentivirus vector inh
4、ibiting MMP9 expression is successfully constructed, laying foundation for the research in vivo.【Key words】 Matrix metalloproteinase (MMP)9; RNA interference; Lentivirus vector动脉粥样硬化(AS)斑块破裂是急性缺血事件的主要原因。细胞凋亡和基质降解机制与斑块破裂过程有关1 。循环中细胞外基质(ECM)标记物的水平常常与 AS 疾病的危险分层密切相关。基质金属蛋白酶(MMPs)降解 ECM，破坏动脉壁的完整性，触发急性动脉
5、血栓形成2 。MMPs 是与ECM 蛋白质降解密切相关的蛋白水解酶，在组织重塑过程中起重要作用3 ，是造成 AS 斑块不稳定的重要原因之一。不稳定的人 AS 斑块局部MMPs 的主要来源为单核细胞/巨噬细胞，而 MMPs 的主要成分是 MMP2 和94 。因此，抑制 MMP9 在不稳定斑块中的表达，可能抑制斑块破裂。为此，本实验构建小鼠 MMP9 RNA 干扰(RNAi)质粒，采用 Western印迹和实时荧光定量 PCR 法，验证 MMP9 干扰质粒在工具细胞中的沉默效应，为进一步在体研究奠定基础。1 材料与方法1.1 材料 由上海吉凯基因有限公司构建合成并包装的 MMP9 RNAi 慢病毒
6、载体;DMEN、胎牛血清(Gibco 公司);胰蛋白酶(上海化学试剂公司);Lipofectamine2000、Trizol(美国 Invitrogen 公司);兔 GFP 多克隆(Abcam 公司);山羊抗兔 IgGHRP(Santa Cruz 公司);预染的蛋白标志物(中晶公司);荧光显微镜(Olympus 公司);实时荧光定量 PCR 仪器(BioRad 公司)。1.2 方法1.2.1 Western 印迹检测 293T 细胞中 MMP9 表达 将构建好的MMP9 基因过表达克隆质粒和针对不同靶点 RNAi 病毒载体质粒，共转染入 293T 细胞，于转染后 72 h，收集培养上清行 12
7、%SDS 聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳，电转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，用TBST(TBS+0.05%Tween20)加 5%脱脂奶封闭过夜;用含 5%脱脂牛奶的 TBST稀释与一抗相应的辣根过氧化物酶驴抗小鼠二抗(14 000)，于室温下孵育 2 h，用 Amersham 公司 ECL+plusTM Western 印迹试剂盒检测蛋白表达。1.2.2 实时荧光定量 PCR 检测 NIH3T3 细胞中 MMP9 mRNA 的表达 NIH3T3 细胞慢病毒感染实验在 6 孔板中进行，分为正常对照组、阴性对照组和 RNAi 组。MMP9 基因引物采用 Beacon designer 2 软件设
8、计，上游引物：GGCGTGTCTGGAGATTCG，下游引物：TACTGGAAGATGTCGTGTGAG;分别取转染后的 NIH3T3 细胞，按 Invitrogen 公司的 Trizol 操作说明书抽提细胞总 RNA;RNA 逆转录获 cDNA，在 Biorad 的 iQ5 上完成实时荧光定量 PCR 检测。1.2.3 荧光显微镜观察 GFP 表达 将生长状态良好的 NIH3T3，在病毒感染前一天分入 6 孔培养板培养，感染当天按实验设计的组别分别加入不同复合感染(MOI)的 RNAi 慢病毒颗粒进行感染实验。感染 72 h 后荧光显微镜下观察 GFP 表达情况，进而判断 MMP9 的干扰效
9、果。1.3 统计学处理 采用 SPSS11.0 统计软件进行 2 检验。2 结 果2.1 293T 细胞中 Western 印迹鉴定慢病毒介导的 RNAi 于转染后72 h，收集培养上清作 Western 印迹检测，利用 0.25 和 0.5 g 两种不同质粒浓度进行实验。1#、2#、3#这三种不同干扰靶点的敲减作用不同，2#对 MMP9 有显著的敲减作用，在两个质粒浓度下的作用是一致的;3#也有一些敲减作用，特别是在高质粒浓度下;1#靶点基本没有作用，如图1。PC 为 MMP9 阳性参照;NC1 为共转染过表达融合蛋白质粒，加 NC RNAi 质粒的细胞组;NC2 为针对鼠源 GAPDH 的
10、有效干扰载体,作为第二个阴性对照;1#、2#、3# 为共转染过表达融合蛋白质粒，不同靶点加 RNAi质粒的细胞组图 1 Western 印迹检测 293T 细胞中 RNAi 作用2.2 实时荧光 PCR 定量检测 NIH3T3 中 MMP9 mRNA 的干扰作用 分别提取转染后的 NIH3T3 细胞总 RNA，利用实时荧光 PCR 定量分析各组MMP9 mRNA 表达量的变化。RNAi 组 MMP9 mRNA 相对表达量为 0.25，阴性对照组为 1.00，正常对照组为 1.52。RNAi 组在 NIN3T3 细胞上对MMP9 mRNA 基因表达有显著干扰作用，干扰效率 75%以上，与其他两组
11、比较有显著差异(P0.01)。2.3 NIH3T3 细胞感染病毒的荧光观察 慢病毒载体上带有 GFP 绿色荧光基因标记，在 488 nm 蓝光照射下可激发出 507 nm 的绿色荧光。感染 72 h 后在荧光显微镜下可见，阴性对照组几乎 100%的 NIH3T3 细胞都可发出绿色荧光，说明 MMP9 过表达质粒大量转染入 NIH3T3 细胞;慢病毒介导的 RNAi 组绿色荧光表达明显减少，说明慢病毒介导的 RNAi 能够有效抑制 MMP9 表达。见图 2。图 2 RNAi 靶点验证荧光图3 讨 论基因治疗的关键在于筛选有效基因、构建高效表达载体、定位靶向治疗。以往实验研究中常用的载体有腺病毒和
12、逆转录病毒载体。腺病毒载体是基因治疗常用的病毒载体，具有感染能力强、滴度高、多拷贝高效性、无插入突变性等优点5 ，但是目的基因不能整合至靶细胞基因组，仅能短暂表达，且反复应用容易引起免疫反应。逆转录病毒载体虽然可以使目的基因整合至靶细胞基因组，实现稳定表达，但只能转导分裂期细胞，不能转导非分裂期细胞。慢病毒载体来源于人类免疫缺陷病毒1(HIV1) ，具有可感染非分裂期细胞、容纳外源性目的基因片段大、免疫反应小等特点，因此越来越受到人们重视。RNAi 是双链 RNA 分子在 mRNA 水平上诱发的序列特异性转录后基因表达沉默6，7 。作为一种反向遗传学手段，RNAi 广泛应用于基因功能分析、信号
13、转导通路研究和基因治疗之中。由于慢病毒载体介导的 RNAi 作用时间持久，不易诱发宿主免疫反应，因此慢病毒成为基因治疗载体研究的热点。 用慢病毒载体介导 RNAi 的研究810显示，该技术在基因功能和基因治疗等领域具有广泛的应用前景。MMPs 是活性依赖于内源性 Zn2+及 Ca2+的存在、主要由平滑肌细胞和巨噬细胞分泌和表达的一类蛋白水解酶，目前发现有 16 种以上。Peter 等11的研究显示，巨噬细胞过表达活化的 MMP9 时显著增加弹力蛋白的降解，诱导有效的斑块破裂。因此，抑制 MMP9 的表达可能对 AS 的进程及不稳定斑块的破裂产生重要影响。本实验以 MMP9 为干扰靶点构建的慢病
14、毒载体，在生长状态良好的工具细胞中，通过 Western 印迹和实时荧光定量 PCR 验证其靶点的有效性，结果显示构建的慢病毒载体能够有效敲减工具细胞中 MMP9 表达。这为以后的动物体内基因治疗研究奠定了基础。【参考文献】1 Molloy KJ，Thompson MM，Jones JL,et al.Unstable carotid plaques exhibit raised matrix metalloproteinase8 activityJ.Circulation，2004;110：33743.2 Virmani R，Kolodgie FD，Burke AP,et al.Atheros
15、clerotic plaque progression and vulnerability to rupture：angiogenesis as a source of intraplaque hemorrhageJ.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2005;25:205461.3 Batlle M，PrezVilla F，GarcaPras E,et al.Downregulation of matrix metalloproteinase9 (MMP9) expression in the myocardium of congestive heart failu
16、re patientsJ.Transplant Proc，2007;39(7):23446.4 Libby P.What have we learned about the biology of atherosclerosis? The role of inflammationJ.Am J Cardiol，2001;88(7B):3J6.5 Xia D,Zhang MM,Yan LN.Recent advances in liverdirected gene transfer vectorsJ.Hepatobil Pancr Dis Int,2004;3(3):332.6 Meister G，
17、Tuschl T.Mechanisms of gene silencing by doublestranded RNAJ.Nature，2004;431(7006)：3439.7 Zamore PD，Haley B.Ribogenome ：the big world of small RNAsJ. Science，2005;309(5740):151924.8 Bot I，Guo J，Van Eck M,et al.Lentiviral shRNA silencing of murine bone marrow cell CCR2 leads to persistent knockdown o
18、f CCR2 function in vivoJ.Blood，2005;106:114753.9 Klinghoffer RA，Roberts B，Annis J,et al.An optimized lentivirusmediated RNAi screen reveals kinase modulators of kinesin5 inhibitor sensitivityJ.Assay Drug Dev Technol，2008;6(1):10519.10 柳玉红，李建明，周 军,等.PRL3Y 基因 RNA 干扰慢病毒载体的构建及在 SW 细胞中的表达J.南方医科大学学报,2008;28(4);50912.11 Peter J，Gough IG，Gomez PT,et al.Macrophage expression of active MMP9 induces acute plaque disruption in apoEdeficient miceJ.J Clin Invest，2006;116:5969.
