1、小鼠免疫力对接种人类肝癌细胞系 9724 生长的影作者：张志培，施新猷，李六金 ，刘雪松，江逊 ，彭磊，赵佐庆 【关键词】 肝癌细胞 关键词: 肝癌细胞;接种;免疫缺陷小鼠;T 细胞;细胞毒;流式细胞仪 摘 要:目的 探讨不同免疫力小鼠的免疫细胞对人类肝癌细胞系9724 生长的影响及异种特异性细胞毒杀伤能力. 方法 将培养后的人类肝癌细胞系接种到不同免疫力小鼠（免疫正常的 BALB/c，B 缺陷的CBA/N，T 缺陷的 BALB/c nude 及 T，B 缺陷的 C.B-17SICD 小鼠）右后臀皮下，观察其生长;取实验和相应的正常鼠脾细胞进行细胞毒杀伤试验. 结果 BALB/c 和 CBA/
2、N 小鼠不成瘤;BALB/c nude 和 C.B-17SCID 小鼠 100%成瘤;SCID 免疫重建组用 BALB/c 外周淋巴细胞重建 SCID（BALB/c-PBL-SCID）的不成瘤，用 CBA/N 外周淋巴细胞重建的 SCID（CBA/N-PBL-SCID）成瘤，接种过瘤的 BALB/c 和 CBA/N 小鼠脾细胞对癌细胞有较强的细胞毒杀伤作用，对照组和 nude，SCID 小鼠无杀伤作用;SCID 免疫重建有较小的杀伤作用. 结论 T 细胞在异种瘤移植排斥中起主要的免疫杀伤作用，这种排斥是异种特异性的;肿瘤免疫需要综合性免疫作用. Keywords:hepatocarcinoma
3、 cell;vaccination;immunodefi-cient mice;T lymphocytes;cytotoxicity;flow cytometry Abstract:AIM To explore the effect of immune cells in var-ious mice with different immune on growth of human hepato-carcinoma cells in these mice and xenospecific cytotoxicity of these mice to hepatocarcinoma cells.MET
4、HODS The hu-man hepatocarcinoma cells cultured were inoculated subcuta-neous into the posterior limbs in various mice with different immune（including normal immune mice-BALB/c，B lympho-cyte deficient mice-CBA/N，T lymphocyte deficient mice-BALB/c nude and T，B lymphocytes combined deficient mice-C.B-1
5、7SCID）and their growth in the mice.Were surveyed And the spleen cells were harvested from both experiment groups in5weeks after being inoculated and from control groups a to examine direct cytotoxicity to the hepatocarci-noma cells.RESULTS There were no carcinoma growth in BALB/c，CBA/N mice and immu
6、noreconstructed SCID mice with BALB/c mice peripheral blood lymphocytes（BALB/c-PBL-SCID）but100%carcinoma growth in SICD，nude and immunoreconstructed SCID mice with CBA/N mice peripher-al blood lymphocytes（CBA/N-PBL-SCID）.And the spleen cells in experiment groups of BALB/c and CBA/N mice dis-played s
7、trong cytotoxicity to target cells and the lymphocytes of immunoreconstructed SCID mice generated a little lysis of target cells，but those of control groups and nude，SCID mice generated no lysis of target cells.CONCLUSION Tlympho-cytes which are xenospecific cytotoxic mayplay a main role of immune k
8、illing in rejection to xenografted tumor but the com-prehensive immune may be necessary in the tumor immunity. 0 引言 肝癌是严重威协人类生命的主要肿瘤之一，因此对肝癌的研究十分重要.肝癌的治疗除了早期诊断切除、介入导向、化疗、放疗外，免疫治疗及其基础研究仍十分重要1 .细胞免疫对肿瘤的排斥占有极其重要的地位，其中 CD4+ 和 CD 8+ 淋巴细胞都能识别肿瘤细胞，而 CD 8+ 通过溶解作用能直接杀伤许多肿瘤，因此是抗肿瘤的主要效应细胞2 .CD4+ ，CD8+ 及 NK 细胞在
9、同源肿瘤移植排斥中的研究有重要的意义3，4 ，异种特异性 T 细胞对肿瘤排斥作用的研究也占有重要的地位5，6 .我们通过将人类肝癌细胞系 9724 培养后接种到不同免疫力小鼠体内，观察肿瘤生长的差异性，测定 CD4+ ，CD8+ 百分比例及细胞毒杀伤性，探讨免疫细胞对肿瘤生长的影响. 1 材料和方法 1.1 材料 本中心建立的人类原发肝癌细胞系（HCC-9724） 7 用含 100mL L-1 小牛血清，10 万 U L-1 青霉素和 10 万 U L-1 链霉素的 RPMI1640 完全培养液置 37，50mL L-1 CO2 孵箱中培养，到一定数量的对数生长期时，用 2.5mg L-1 胰
10、酶（含 2mg L-1 的 EDTA）消化、离心、调整细胞数后接种到小鼠上.BALB/c 小鼠 15 只，CBA/N 鼠 15 只，BALB/c nude5 只，皆为本中心繁殖的近交系或突变系实验小鼠，体质量 1822g，68 周龄，雌雄兼用.其中 CBA/N，BALB/c nude 小鼠三级实验动物 BALB/c 为二级动物.C.B-17SCID 小鼠 15 只从解放军军事医学科学院动物中心提供的三级实验动物，体质量 1518g，58 周龄，用 ELASA 法检测无“渗漏”现象.全部实验小鼠都饲养在无特定病原体（SPF）条件中. 1.2 方法 BALB/c 和 CBA/N 各分为 2 组皮下
11、组，用于不同癌细胞数量的接种;BALB/c nude 鼠和 SCID 只有一组皮下，每组 5 只.另外 BALB/c 和 CBA/N各 5 只分别用于重建 SCID 小鼠免疫.在无菌条件下操作，摘除小鼠眼球取血，常规 Ficoll 密度法分离淋巴细胞，用 RPMI1640 洗涤两次（1500r min -1 ，10min） ，重新用 RPMI1640 悬浮，取 1 滴悬液与 1 滴 2g L-1 台盼蓝染液混合，于计数板上计数活细胞，调整细胞数 21010 L-1 ，于接种瘤细胞 3d 前给 SCID 小鼠 ip0.4mL.以癌细胞 31010 L-1 接种各小鼠右后肢臀部皮下 0.2mL（包
12、括 SICD 免疫重建组）.因 BALB/c 和CBA/N 小鼠没成瘤，又以 11011 L-1 接种这两种小鼠右后肢臀部皮下0.2mL.SCID 小鼠在接种瘤细胞前分别称重，各鼠接种癌细胞 1wk 后开始，每 wk 同一时间进 SPF 楼，观察肿瘤生长情况，长出瘤体用游标卡尺测量，体积根据公式 V=ab2 /2（a-短径，b-长径）计算2 ，同时，SCID 小鼠每 wk 称质量.5wk 后处死，称瘤体质量. 1.2.1 小鼠脾细胞毒杀伤功能检测 鼠经脱颈处死，用 750mL L-1 乙醇浸泡，在超净台中无菌取脾脏，研磨制成脾细胞悬液，洗涤后用 100mL L-1 FCS RPMI1640 调
13、整 11010 L-1 ，内加高剂量 IL-2（10 万 U L-1 ）和经 5Gy 照射的肝癌细胞（1109 L-1 ） ，加到 24 孔培养板中，于 50mL L-1 CO2 孵箱中培养诱导 5d.取对数生长期的癌细胞 1109 L-1 ，加 N512 CrO4 3.7MBq 于37孵育 3h（每 15min 轻轻振 摇 1 次） ，取出用 100mL L-1 FCS RPMI1640 洗涤 3 次 （800r min-1 ，5min）重新悬浮，调整细胞数加入 96 孔培养板（每孔 100L 含1104 细胞） ，同时每孔加 100L 不同浓度的效应细胞，每份 3 个复孔，效靶比例为 10
14、0 1，50 1，25 1，12.5 1.最大释放组加入 10g L-1 TritonX-100100L，自然释放组加 100L 的完全培养液，在 37CO2 孵箱中培养 4h.然后每孔取上清液 100L，于 计数仪上测定 cpm 值，计算:特异性杀伤率（%）=（实验释放 min-1 -自然释放 min-1 ）/（最大释放 min-1 -自然释放 min-1 ）. 1.2.2 CD4+ 和 CD8+ T 细胞百分率测定 以 31010 L-1 接种的CBA/N 和 BALB/c 及正常相应鼠 5wk 后取血，置抗凝管中，用 FITC 标记的抗 CD4+ 和 CD8+ 抗体与全血混匀，室温下放置
15、 15min 后，用 Qprep 自动细胞制备仪，加 A，B，C 液溶解红细胞和稳定淋巴细胞，再用 PBS 洗细胞 1 次，轻轻荡，立即上 FCM（美国 Coullter 公司 Profile型）检测，于波长 488nm 计数 110 4 个淋巴细胞中各标记的 T 细胞数分数8，9 . 2 结果 2.1 小鼠癌体生长 以 31010 L-1 接种小鼠皮下后，BALB/c 和 CBA/N 鼠没出现癌细胞结节，而 nude，SCID 成瘤率达 100%，且都随时间而增大;两种免疫重建 SCID 小鼠也有不同的癌结节表现，BALB/c-PBL-SCID 癌结节到 5wk 全部消失，CBA/N-PBL
16、-SCID3wk 以后有逐渐缩小的现象（Fig1（略） ）. 最后所称的癌体质量均值为 SCID 组nude 组（P0.05） ，SCID 和 nude 组CBA/N-PBL-SCID 组（皆为 P0.01）.当用11011 L-1 癌细胞数接种到 CBA/N 小鼠后，出现癌体一时性增大，5wk 时全部消失（Fig1（略） ）.还有另一现象，SCID 小鼠的体质量随瘤体积增大而减小（Fig2（略） ，nude 没有称质量） ，SCID 和 BALB/c-PBL-SCID 小鼠癌体的大小与其各自体质量呈负线性关系（分别为 r=-0.995，P0.01 和 r=-0.953，P0.05）.CBA/
17、N-PBL-SCID 癌体大小与其体质量没明显的负线性差异，但存在背离现象. 2.2 细胞毒对肿瘤的杀伤 BALB/c 和 CBA/N 的脾细胞对肝癌细胞系 9724 的杀伤有意义，在效靶比例 100 1 时，前者为（28.45.2）%，后者为（31.313.2）%（自然释放率约为 8.5%）.CBA/N-PBL-SCID 为（7.40.5）%，BALB/c-PBL-SCID 为（6.40.6）%.SCID 和 nude 小鼠只有微小的杀伤作用（Fig3（略） ）.不同小鼠的不同效靶比例对癌细胞杀伤线图如 Fig4 所示.相应对照鼠脾细胞进行试验时不产生杀伤效应. 2.3 CD4+ 和 CD8
18、+ T 细胞 正常 CBA/N 小鼠的 CD4+ 和 CD8+ 数分数高于 BALB/c，其中两组 CD 4+ 之间有差异，CD4+ /CD8+ 正常，接种肿瘤后发生变化（Tab1）.表 1 CBA/N 和 BABL/c 小鼠 CD（略） 3 讨论 在肿瘤免疫中，认为 T 细胞起着最重要的作用，NK 细胞在抗肿瘤及抗转移中起着不可忽视的作用3，4，10 .从肝癌细胞接种到 4 种小鼠所建模型看，具有 T，B，NK 三大免疫细胞的 BALB/c 小鼠排斥肿瘤最强;有 T，NK 细胞而 B 细胞缺乏的 CBA/N 小鼠排斥力仍很强，但随接种瘤细胞量增加，出现癌体增大又逐渐缩小至消退的现象.可见 B
19、 淋巴细胞缺乏的 CBA/N 小鼠，排斥力仍强，然有所下降.尽管 nude 鼠有 B 淋巴细胞和 NK 细胞，由于缺乏 T 细胞已无法阻止肿瘤进行性生长增大.SCID 小鼠是一种严重联合免疫（T，B 细胞）缺陷小鼠，NK 细胞有所增高11 .本实验并没象文献3，10报道的那样 NK 有较强的排斥肿瘤作用，而是 SCID 瘤体比 nude 鼠癌体长得更快.免疫重建 SCID 小鼠的移植癌体的生长曲线说明免疫重建是成功的，也更证明了 BALB/c 和 CBA/N 免疫排斥肿瘤的特点.因而可推测，单独 NK 或 B 淋巴细胞的存在，或 NK 和 B 细胞同时存在都无法阻止肿瘤的生长，T 细胞对肿瘤的
20、排斥起最重要的作用，但并非 B 淋巴细胞和 NK 细胞不起作用.本组细胞毒杀伤实验基本符合小鼠免疫特点，更进步证明 T 细胞在肿瘤中的作用.正常 CBA/N 的 CD4+ 和CD8+ T 细胞百分率比 BALB/c 中的含量高，而本组 CBA/N 的脾细胞杀伤能力也高于 BALB/c，这与 T 细胞毒是一致的，也与另一文阐述相一致5 .BALB/c 和 CBA/N 免疫重建 SCID 小鼠其细胞毒杀伤力较小，且前者高于后者，表明这一免疫重建是真实的，也符合该小鼠免疫特点，因为我们是通过 ip 进行免疫重建的.nude 和 SCID 有微小的杀伤力并不能说结果与理论相矛盾，因诱导过程可激活 NK
21、 至 LAK 细胞起到杀伤作用.非接种肿瘤 4 种小鼠脾细胞实验时无细胞毒杀伤力，这表明 T 细胞毒是特异性的. 另一问题是 CBA/N 中的 T 细胞百分率及杀伤力都比 BALB/c 高，而BALB/c 对肿瘤的排斥力则大于 CBA/N;nude 鼠中 B 淋巴细胞的存在却对肿瘤没出现明显的抑制.因此，综合几种小鼠对肿瘤的排斥性及细胞毒性作用，可以这样认为 T 细胞在直接杀伤肿瘤中起主要的作用，B 淋巴和 NK细胞也有排斥作用，但各种淋巴细胞和 NK 细胞不是简单的相加或相减，可能他们之间还存在着一种协同促进的作用;相反，一旦有一种缺乏，就会影响另一种细胞应有的作用.但也并非象有的作者认为，
22、T 细胞在抗肿瘤作用时，必需有共同刺激分子（如 B7-1）的存在12 ，本文结果显示 T 细胞和 B 细胞都能单独发挥杀伤肿瘤的效应，可能是非 B 淋巴细胞依赖性 T 细胞杀伤作用或非 T 细胞依赖性的 B 淋巴细胞抗肿瘤. 那么 T 细胞对人类肝癌细胞的杀伤是特异性的免疫防御作用还是异种排斥作用?Sandrin 等 13 认为异种移植的急性或超急性排斥反应主要由抗体和补体介导引起的;虽然，淋巴细胞介导的细胞毒也参与异种移植非急性排斥反应，但主要由 CD4+ 和 NK 细胞引起14，15 .具有穿孔素通路细胞毒的小鼠（如 CBA/N，BALB/c 等）针对人类肿瘤引起的细胞毒杀伤主要由异种特异
23、性 CD8+ 细胞介导的，是异种特异性 T 淋巴细胞的特异性免疫反应4 .本文接种癌细 胞和非接种癌细胞的细胞毒杀伤试验及肿瘤接种后 CD4+ ，CD8+ 的细胞含量的变化都证明 T 细胞毒的杀伤是异种特异性细胞毒免疫反应，也可推测是主要由 CD8+ 细胞介导的，CD4+ 起辅助作用. 参考文献: 1Wang J，Ma CL，Xin XY，Liu Yf，Sun C，Jin BQ.The clinical significance of the alteration of IL-2，SIL-2R and mIL-2R levels in patients with ovarian cancer
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