1、缬沙坦和安体舒通对大鼠急性心肌梗死后基质金属蛋白酶及胶原的影响【摘要】 目的 观察缬沙坦和安体舒通对大鼠急性心肌梗死(AMI)后心肌间质基质金属蛋白酶(MMPs)及胶原水平的影响。方法 SD 大鼠 AMI 模型随机分成模型组、缬沙坦组、安体舒通组、缬沙坦+安体舒通组。每组分为 1、2、3 w 3 个亚组。应用逆转录聚合酶链反应法(RTPCR) 及免疫组化方法检测基质金属蛋白酶 2、9 及氯胺 T 波测定胶原。结果 缬沙坦组及合用药组 MMP2 、MMP9 表达与模型组有显著差异(P0.05)。在 1、2、3 w 时，缬沙坦组 MMP2 mRNA 及 MMP9 mRNA 表达水平均显著低于模型组
2、(P0.05)。在 2、3 w 缬沙坦组及合用药组胶原含量和/型胶原比值均显著低于模型组，在 3 w 时安体舒通组显著低于模型组，合用药组显著低于缬沙坦组与安体舒通组(P0.05)。结论 大鼠AMI 后心肌间质 MMP 表达增高，非梗死区胶原比例升高。缬沙坦组可抑制MMP 的表达，改善胶原比例。缬沙坦加用安体舒通可进一步改善胶原含量和比例。 【关键词】 缬沙坦;安体舒通;心肌梗死;基质金属蛋白酶;胶原急性心肌梗死(AMI)后左室重构是不良预后的强有力预测因素，左室重构包括心肌细胞和细胞外成分改变，进行性心室扩大和收缩功能减弱与不良结果密切相关，胶原基质对左室重构起关键作用1 ，保持细胞外基质完
3、整可能限制局部和整体心室重构。细胞外基质结构的完整受基质金属蛋白酶(MMPs)活性的调节2，3 ，但 MMPs 确切作用尚不明确，抑制 MMPs 活性可能减轻心肌梗死(MI)后心室重构，有利于改善心功能4 。缬沙坦对 MMPs 和胶原的作用研究尚少，本文研究大鼠 MI 后给予缬沙坦、安体舒通及合用对大鼠 MI 后心肌组织 MMP2 、MMP9 表达及胶原水平的影响。1 材料与方法1.1 动物模型建立和实验分组 健康雄性 SD 大鼠，由河北医科大学实验动物中心提供，1215 周龄，体重 210260 g。按照文献介绍的方法4 ，结扎冠状动脉左前降支建立 AMI 动物模型。心电图示、avl导联 S
4、T 段抬高1 mv 表明结扎成功。另设假手术组，不结扎冠状动脉。24 h 后 MI 动物随机分为模型组(n=24)、缬沙坦组(n=24)、安体舒通组(n=24)和合用组(缬沙坦+安体舒通,n=24)，各组再分为不同时间段，即1、2、3 w 不同时段。缬沙坦组药物剂量 30 mgkg-1d-1,安体舒通组药物剂量 20 mgkg-1d-1,合用组(缬沙坦 30 mgkg-1d-1+安体舒通 20 mgkg-1d-1)。药物加生理盐水 2 ml 配成溶液，直接灌胃给药，每日 1 次。假手术组和对照组大鼠灌等量生理盐水。3 w 时取材，麻醉后开胸，取出心脏，在冰上操作，于冰生理盐水中冲去残余血液，在
5、梗死区周围剪取心肌组织，迅速置于液氮罐内保存，再转至-80 冰箱保存。1.2 MMP2 、MMP9 的 mRNA 测定 心肌组织总 RNA 的提取：Trizol 试剂盒购自美国 Promega 公司，缬沙坦由诺华公司提供，安体舒通为杭州民生药业集团有限公司产品，引物为北京华美生物工程公司产品。取心肌组织约 100 mg,按实验操作规程提取 RNA，之后进行RTPCR 。MMP2 引物序列：正义：5GAGTTGGCAGTGCAATACCT3 ，反义：5GCCATCCTTCTCAAAGTTGT3 ，MMP9 引物序列：正义:5CGGTATTGGAAGTTCTCGAAT3 ，反义:5CACACGCC
6、AGAAGTATTTGTCATG3 。参照文献，进行 MMPs 引物设计及合成。PCR 配制反应体系，反应体系构成如下 10PCR 缓冲液 5 l，25 mmol/L MgCl2 溶液 3 l，2 mmol/L dNTP5 l，50 pmmol/L上游引物 1 l，50 mmol/L 下游引物 1 l， cDNA 2 l，TaqDNA 聚合酶(3 U/l)0.7 l，DEPC 水 29.5 l。进行 PCR，扩增后进行电泳及凝胶分析，紫外透射仪上观察结果，读胶仪读取各电泳条带的光密度值，结果以 MMP2 、MMP9 与 actin 光密度比值表示。1.3 心肌组织免疫组化染色 心肌组织用石蜡包
7、埋后，以 6 m 的厚度连续切片，进行 MMP2 、MMP9 的免疫组化染色。方法如下：石蜡切片脱蜡至水，3%甲醇 双氧水室温孵育 10 min，消除内源性过氧化物酶的活性，蒸馏水冲洗，0.01%PBS 缓冲液(pH7.4)洗 5 min，0.1 ml 枸橼酸缓冲液(pH6.0)微波抗原修复 98 20 min，冷却至室温，10%正常家兔血清稀释封闭，滴加 150 稀释 MMP2 、MMP9 一抗 4冰箱过夜，在清洗后，加入 DAB 显色剂 5 min，自来水终止显色，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照用 PBS 替代一抗，其余步骤同上。实验结果判定：在细胞浆内表达，阳性反应
8、均呈棕黄色或黄色。1.4 心肌胶原含量及、型胶原的测定 采用氯胺 T 法：取冻存心肌组织 50 mg,经脱水、脱脂，沉淀烘干并研成粉末，加入 6 mol/L 盐酸 2 ml，110 水解 3.6 h，调节 pH 至 6.0，按说明书要求，用Beckman 的紫外分光光度计，测各管 OD 值，计算出羟脯氨酸含量，心肌胶原含量等于羟脯氨酸含量7.46，得到胶原含量。、型胶原的测定：多聚甲醛固定的心肌组织，固定 1224 h 后，梯度酒精脱水，常规石蜡包埋，连续石蜡切片，每片厚 6 m，取 3 张切片分别按 SP 法进行免疫组化标本切片染色操作。实验结果判定：阳性反应均呈棕黄色或黄色。图像分析系统测
9、定型和型胶原阳性染色所占面积，并分别除以统计场总面积后作为型和型胶原实际面积，取 8 个视野的均值。最后计算/型胶原比值。1.5 统计学方法 采用 SAS 6.12 统计软件对数据进行分析处理;各项数据均以 xs 表示;采用多组间方差分析及 q 检验。2 结 果2.1 各组大鼠心肌组织中 MMP2 、MMP9 mRNA 的表达 模型组MMP2 、MMP9 mRNA 表达于 13 w 时均显著高于假手术组(P0.05)。在 1、2、3 w 时，缬沙坦组 MMP2 mRNA 及 MMP9 mRNA 表达水平均显著低于模型组(P0.05)，安体舒通组 MMP2 mRNA 及 MMP9 mRNA 表达
10、水平与模型组无显著差异(P0.05)。在 1、2、3 w 时，缬沙坦组MMP2 mRNA 及 MMP9 mRNA 表达水平显著低于安体舒通组(P0.05)。合用组 MMP2 mRNA 及 MMP9 mRNA 表达水平显著低于安体舒通组(P0.05);合用组与缬沙坦组无显著性差异(P0.05)(表 1)。表 1 各组大鼠心肌 MMP2 、9 mRNA 的表达表 2 各组大鼠心肌 MMP2 、9蛋白的表达2.2 免疫组织化学结果 与模型组 MMP2 及 MMP9 比较，在1、2、3 w 时，缬沙坦组阳性染色光密度积分有显著降低(P0.05);与模型组 MMP2 及 MMP9 比较，安体舒通组阳性染
11、色光密度积分无显著性差异(P0.05)。缬沙坦组与合用组比较无显著性差异(P0.05);缬沙坦组和合用组与安体舒通组比较有显著降低(P0.05)(表 2)。2.3 缬沙坦、安体舒通及合用药组对非梗死区心肌胶原含量及/型胶原比值的影响 与模型组相比，缬沙坦组在 2、3 w 非梗死区胶原含量显著降低，分别降低 20.9%、28.6%(P0.05);安体舒通组在 3 w 非梗死区胶原含量降低 25%差异显著(P0.05);合用药组在 1、2、3 w 非梗死区心肌胶原含量分别降低 17.9%、23.1%和 42%(P0.05)。缬沙坦组与安体舒通组各时间点的非梗死区胶原含量之间无显著差异;合用药组在
12、3 w 时显著低于缬沙坦组、安体舒通组(P0.05)。/型胶原比值变化同胶原含量变化。见表 3。表 3 各组大鼠心肌胶原含量和/型胶原比值与假手术组比较：1)P0.05;与模型组比较：2)P0.05;与安体舒通组比较：3)P0.05;与其他组比较：4)P0.053 讨 论心室重构包括心肌细胞的变化和细胞外基质的变化，重构取决于细胞外基质的 3D 组织结构和胶原的数量及类型。胶原是主要包括型、型胶原。Kim 等5研究表明，AMI 后愈合过程中心肌细胞外基质的代谢是心室重塑的重要因素，而 MMPs 能降解所有的心肌细胞外基质，被认为是心肌基质重塑的决定因素。MMPs 是一组能特异地降解细胞外基质成
13、分的 Zn2+依赖的蛋白酶家族，其表达受多种化学因素、神经内分泌、细胞因子、细胞骨架结构和基膜黏附性的影响，可以在转录水平得到许多生理信号包括生长因子和基质素的调节。本研究显示，MMP2 mRNA 在心梗后表达均高于假手术组，其心梗后 1、2 w 达高峰，比对照组增加 49%，差异显著。在 3 w 时MMP2 mRNA 水平下降，但仍高于假手术组。免疫组化结果显示 MMP2蛋白含量也有相似趋势。MMP9 mRNA 同样在心梗后表达均高于假手术组，其中心梗后 1、2 w 达高峰，比假手术组增加 50%，差异显著;心梗后 3 w MMP9 mRNA 仍高于假手术组 31%，差异显著。免疫组化测定的
14、结果说明心梗后 MMP9 含量明显升高，作用增强，变化趋势和 MMP9 mRNA 表达趋势相一致。缬沙坦组及合用药组可抑制 MMP2 、MMP9 mRNA 的表达，安体舒通组对 MMP2 、MMP9 mRNA 的表达无影响，合用药组并不优于缬沙坦组。本研究表明，缬沙坦降低 MMP2 、9 mRNA 表达，有利于减轻左室重构，可能途径有:拮抗 MI 后升高的 Ang引起的血流动力学改变，降低其对心肌的负性作用，减少心肌损伤，使氧化型谷胱甘肽和炎性细胞蛋白酶释放减少，进而有效抑制它们对 MMPs 的激活。抑制 MMPs/TIMPs复合物的释放，减缓 MMPs 的激活。通过特异地拮抗 Ang与成纤维
15、细胞的结合，抑制 MMPs 的激活。本研究显示 MI 后胶原含量显著增加，/型胶原蛋白比例上升，在 3 w 时胶原含量和/型胶原比值高于 1 w，提示间质胶原的增生随着时间延长而增多。研究发现心肌缺血后数分钟 MMPs 激活，梗死后 15 min 时显著升高，12 d 达到高峰，型胶原的增生超过型胶原，而胶原酶、明胶酶的活性逐渐下降，使得胶原合成多于胶原分解，有利于梗死区的修复。研究显示，缬沙坦和安体舒通组梗死区胶原含量和胶原比值，3 w 时有明显下降，合用药组优于单用药组，但各组仍高于假手术组，可能有利于梗死区胶原的质的保持，维持梗死区的胶原网络结构。醛固酮主要的作用是促进心肌纤维化，参与左
16、室重构过程。本研究证实安体舒通可减少非梗死区胶原含量及胶原比值，通过减轻左室肥厚而改善左心室重构。缬沙坦和安体舒通均可减轻胶原增生，提示血管紧张素和醛固酮可能通过各自受体发挥作用。缬沙坦主要减少型胶原，而安体舒通主要减少型胶原，二者在受体水平阻断 RAAS 不同位点，在改善心室重构方面有协同作用。【参考文献】1 Squire IB,Evans J,Ng LL.Plasma MMP9 and MMP2 following acute myocardial infarction in man：correlation with echocardiographic and neurohumoral p
17、arameters of left ventricular dysfunctionJ.J Cardiac Fail，2004;10(4):32833.2 Eric MW,Sina L.Regionand typespecific induction of matrix metalloproteinases in postmyocardial infarction remodelingJ. Circulation,2003;107(23)：285763.3 Webb CS,Bonnema DD,Ahmed SH,et al.Specific temporal profile of matrix
18、metalloproteinase release occurs in patients after myocardial infarction：relation to left ventricular remodelingJ.Circulation，2006;114(10):10207.4 Rupak M,Brinsa TA,Dowdy KB,et al.Myocardial infarct expansion and matrix metalloproteinase inhibitionJ.Circulation,2003;107(4)：61825.5 Kim HE,Dalal SS,Young E,et al.Disruption of the myocardial extracellular matrix leads to cardiac dysfunctionJ.J Clin Invest,2000;106(7):85766.
