1、心肌梗死患者外周血单个核细胞基质金属蛋白酶 9mRNA 的表达【摘要】 目的：探讨单个核细胞(PBMC)中基质金属蛋白酶 9(MMP9)在心肌梗死(AMI)病理生理机制中的作用。方法:用电化学发光法检测 30例 AMI 患者与对照组 30 例血浆肌钙蛋白 T(cTnT)的含量;用 ELISA 法测定血浆 MMP9 的含量及 RTPCR 检测单个核细胞中 MMP9mRNA 的表达水平。结果: AMI 患者在 6 h 及 1 周内 MMP9 的含量分别为(697143 ) ng/mL,(597102 ) ng/mL 较对照组的(342165 ) ng/mL 显著增高(P0.05)，与 cTnT 的
2、变化差异无统计学意义(P0.05)，且呈正相关(r=0.82, P0.05)。AMI 患者单个核细胞 MMP9mRNA 表达显著增强。结论: AMI 患者 PBMC 处于炎性状态，MMP9mRNA 表达增强，并可能由此导致血浆 MMP9 水平增高。监测血浆 MMP9 的水平有可能成为了解AMI 发生发展的一个重要诊断指标，为 AMI 的治疗和预后提供临床依据。 【关键词】 心肌梗死; 基质金属蛋白酶 9; 单个核细胞; 肌钙蛋白 TMatrix metalloproteinase9 mRNA expression of peripheral blood mononuclearcell in p
3、atients with acute myocardial infarctionRONG Hong1, SANG Shenggang2(1.Department of Stomatology; 2. Clinical Laborary Department, Affiliated Hospital of Hainan Medical College, Haikou 570102, China)ABSTRACT Objective: To investigate the role of matrix metalloproteinase9 (MMP9) in the development of
4、acute myocardial infarction (AMI). Methods: The plasma troponin T of both 30 acute myocardial infarctions and 30 control cases were measured by automatic electrochemiluminescence analysis; plasma MMP9 levels were quantified with enzymeimmunoassay method (ELISA); and mRNA expression of MMP9 extracted
5、 from mononuclearcell were detected by RTPCR method. Results: MMP9 levels of the AMI group within 6 h and during the first week were (697143) ng/mL and (597102) ng/mL separately, both of which were significant higher than (342165 ) ng/mL of the control group (P0.05). There was a positive correlation
6、 between the levels of MMP9 and cTnT (r=0.82, P0.05) though no significant difference was found. The MMP9 mRNA expressions were obviously amplified in peripheral blood mononuclearcells. Conclusion: The study demonstrats that the concentration and expression of MMP9 mRNA are significant higher in pat
7、ients with myocardial infarction than that in control group. The activated peripheral blood mononuclear cells and enhanced MMP9 mRNA expression may result in the increase of the MMP9 concentration in plasma of the patient. Thereby, the MMP9 level of plasma can be valued as an important index for the
8、 diagnosis, treatment and prognosis of acute myocardial infarction.KEY WORDS Matrix metalloproteinase9; Acute myocardial infarction; Mononuclearcell; Troponin T心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是严重危害人类健康的疾病，冠状动脉粥样硬化斑块破裂与触发血栓形成是导致 AMI 的一个重要机制1。基质金属蛋白酶 9(matrix metal Oproteinase9,MMP9) 是引起斑块破裂的主要内在
9、因素之一。AMI 患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclearcell, PBMC)处于炎性状态，PBMC 在病灶组织内皮下的浸润、聚集，是动脉粥样硬化及AMI 等疾病发生的早期重要环节。有研究表明2 ，在粥样硬化斑块及AMI 组织，浸润的 PBMC 大量表达 MMP9 ，MMP9 能特异性地与细胞外基质相结合、降解细胞外基质，导致斑块不稳定，易形成血栓，发生 AMI，并加重继发性心肌损害。本文采用细胞培养及分子生物学技术，检测2007 年 10 月2008 年 12 月海南医学院附属医院心内科 AMI30 例患者单个核细胞 MMP9 表达水平的变化，探讨单个
10、核细胞 MMP9 在 AMI 病理生理机制中的临床意义。1 材料与方法1.1 仪器与试剂全自动电发光分析仪(HITACHI Elecsys2010),cTnT(Roche)，MMP9( 上海森雄科技实业有限公司), 自动酶标仪(美国宝特 ELx800 型)，自动洗板机(芬兰 Lab systems D ragon )，pUC Mix Marker(上海生物工程公司)，MMP9 引物、actin 引物(大连宝生物有限公司)，GeneAmP PCR System 2400(美国 PERKIN ELMER)，TGL16WS 台式高速离心机(长沙湘仪礼离心机仪器有限公司)，电泳仪(北京市六一仪器厂DY
11、Y7B 型)，凝胶成像系统(德国 Herolab UVT28) 。1.2 资料来源本组 AMI 患者 30 例，男性 18 例,女性 12 例,平均年龄(58.67.5)岁，全部符合临床诊断标准3。心肌梗死部位包括前壁梗死 13 例，间壁梗死 10 例，下壁梗死 5 例，侧壁梗死 2 例。对照组来自同期海南医学院附属医院体检中心体检者 30 例，男性 19 例,女性 11 例,平均年龄(56.45.2)岁。所有对象应排除急慢性感染性疾病、肝病、脑血管疾病、高血压、高脂血症、肾病、糖尿病及其他自身免疫性疾病。AMI 患者分别在 6 h 内、治疗 1 周内、临出院时静脉采血，正常对照组采空腹血 1
12、 次，均分 2 管，1 管用于 PBMC 分离培养，1 管用于 cTnT、MMP9 的测定。1.3 实验方法(1) PBMC 的分离(Ficoll 法):无菌抽取静脉血 2ml，去掉针头注人含有肝素的无菌试管中摇匀，先作白细胞计数，然后加入 2 mL Hanks(或 PBS)溶液进行对倍稀释，混匀。用吸管吸取稀释血液沿试管壁缓缓加到含有 2 mL 淋巴细胞分离液的试管中血液Hanks(PBS)液淋巴细胞分离液的比例为 111，沿管壁流下的稀释血液叠加在分离液之上，并与分离液形成明显的界面。 经水平式离心 2 000 r/min20 min，小心取出试管。用平口吸管小心吸取中层呈白色雾状的淋巴细
13、胞层，用 Hanks(PBS)溶液洗涤两次，每次离心 1 500 r/min10 min。弃上清，加 RPMI1640 培养液 1 mL 混匀，取少许进行细胞计数及活力测定。将淋巴细胞悬液用 RPMI1640 培养液配成相应的细胞浓度备用。(2)PBMC 培养：细胞均置于含有 10% FBS、100 U/mL 青霉素、100 g/mL 链霉素的含 5%小牛血清的 RPMI1640 培养液中于 37 ，5%CO2 培养箱中培养 7 d，收集 PBMC 进行 RTPCR ，测定 MMP9mRNA 的表达。1.4 单个核细胞 MMP9mRNA 逆转录聚合酶链反应测定(RTPCR)(1)MMP9 引物
14、设计：上游 5AGA CCT GAG AAC CAA TCT CAC3, 下游 5GGC ACT GAG GAA TGA TCT AA3;actin 引物设计：上游 5ATC TGG CAC CAC ACC TTC TAC AAT GAG CTG CG3, 下游 5CGT CAT ACT CCT GCT TGC TGA TCC ACA TCT GC3 。(2)MMP9RNA 提取及 RTPCR 操作严格按照试剂操作说明进行。(3)RTPCR鉴定及电泳分析：取 MMP9 RTPCR 扩增产物 10 L，溴酚蓝上样缓冲液 2 L，于 1.5%琼脂糖凝胶电泳(含 0.5 mg/L 溴化乙锭)，紫外灯
15、下观察，凝胶成像分析系统分析结果、摄像。1.5 统计学处理数据用 SPSS11.5 统计软件处理，采用(s)表示，两组间计量资料均数差异显著性比较用 student t 检验，以 P0.05 为差异有统计学意义，有关指标作直线相关分析。2. 结果2.1 AMI 患者肌钙蛋白、MMP9 含量变化AMI 患者在 6 h 内肌钙蛋白、MMP9 的含量均显著增高，随着治疗好转而下降;与对照组相比，血浆肌钙蛋白、MMP9 在 6 h 内、1 周内均显著增高，差异均有统计学意义(P0.05);而在恢复期则显著降低，与正常对照组相比无统计学意义(P0.05)。MMP9 的含量变化与肌钙蛋白相比无显著性差异(
16、P0.05)并呈现正相关关系(r=0.82, P0.05) (表 1)。表 1 AMI 组及对照组间肌钙蛋白、MMP9 比较注：、VS 对照组 P0.05，VS P0.05。2.2 AMI 患者血清 MMP9mRNA 的表达用 RTPCR 测定 AMI 患者及对照组 MMP9 mRNA 的表达。经凝胶成像系统分析，MMP9mRNA 在 6 h 的 A 值为 4 759，1 周内 A 值为 4 258,恢复期 A 值为 2 846，对照组 A 值 2 651，actin 的 A 值为 3 468。AMI患者单个核细胞 MMP9mRNA 的表达在 6 h 内 MMP9/actin 及 1 周内比值
17、均显著增强，分别达 1.37(4 759/3 468)和 1.23 (4 258/3 468)，与对照组 0.76(2 651/3 468)相比差异有统计学意义(P0.05)。恢复期则显著降低 0.82 (2 846/3 468)，与对照组相比差异无统计学意义(P0.05)。3 讨论基质金属蛋白酶(MMPs) 是酶活性依赖锌离子的蛋白酶超家族，目前已发现的 MMPs 家族成员有 20 多种，根据其底物的特异性和结构的差异分为四大类：胶原酶，明胶酶，基质水解酶，膜型 MMPs。MMP9 是明胶酶中的一种，是 MMPs 中最常见的酶之一，参与了血管的再生、炎症反应等病理过程4。近年研究表明，MMP
18、9 的表达及活性增强参与了 AMI的发生及左室重塑5。本实验研究了 AMI 发生发展过程中 MMP9 含量变化及 MMP9 mRNA 表达情况。循环血液中的 PBMC 与内皮细胞黏附，在血管壁中迁移、吞噬脂质衍化为巨噬泡沫细胞的过程中可分泌大量的 MMP9 。病理研究显示 MMP9 是一种影响粥样斑块不稳定的主要的基质金属蛋白酶6，在 AMI 中 6 h 内 MMP9 即有显著增高，1 周内虽有所下降，但仍高于对照组，表明 MMP9 在 AMI 早期就有大量释放，并随病情的好转而降低，与 Etoh7的报道相一致。本研究显示 MMP9 在 AMI 的发生、发展中的变化规律与 cTnT 相一致，呈
19、良好的正相关关系。目前 cTnT 是公认的诊断 AMI 的酶学指标，进一步说明 MMP9 在 AMI 的发生发展中起着极其重要的作用。Kalela 等8观察血浆 MMP9 水平与冠状动脉造影结果，提出 MMP9 与病情呈正相关，MMP9 水平越高，狭窄越严重，提示血浆MMP9 可以作为动脉粥样硬化及 AMI 等病情活跃的标志物，并可作为随访指标。动脉粥样硬化是全身性的系统疾病，不是局部孤立的病灶，血浆 MMP9 可来源于粥样斑块内的合成分泌，亦可能来源于循环血液中的PBMC9，结合本研究结果，AMI 患者 PBMC 表达 MMP9mRNA ，并可由此导致血浆 MMP9 水平增高。MMP9 参与
20、动脉粥样硬化及 AMI 的病理过程，使粥样斑块易脱落，形成血栓，并在 AMI 发生后，使炎性细胞由血循环浸入缺血心肌组织，加重了继发性心肌损伤及之后的心肌重塑。在 AMI 患者，血浆 MMP9 可来源于 PBMC。因此，在 AMI 预防和治疗中，抑制 MMP9mRNA 的表达，应该成为新的靶点及重要的有效途径。快速检测血浆中 MMP9 的含量有可能成为 AMI 诊断的指标之一。【参考文献】1 Libby P, Ridker PM, Maseri A. Inflammation and atherosclerosisJ. Circulation,2002,105:11351143.2 Loftu
21、s I, Naylor R, goodall S, et al . Increased matrix metalloproteinase9 activity in unstable carotidplaques. A potential role in acute plaque disruptionJ. Stroke,2000,31(1):4047.3 叶任高,陆再英.内科学M.第 6 版.北京:人民卫生出版社,2004.290291.4 朱宏坤，张劲松.4 中性粒细胞蛋白酶(NE)和基质金属蛋白酶(MMP-9)在脓毒症中的变化及临床意义J.实用临床医药杂志, 2008,12(9):4649.
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