1、血小板生长因子对新生鼠缺血缺氧性脑损伤保护作用【摘要】 目的 探讨血小板生长因子 (PDGF)对新生鼠缺血缺氧性脑损伤(HIBD)的保护作用。方法 7 日龄 Wistar 大鼠 72 只，随机分为假手术组、治疗组和对照组，每组 24 只。假手术组仅分离右颈总动脉，治疗组和对照组分离右颈总动脉结扎，低氧 2 h 制备新生大鼠 HIBD 模型。治疗组在成模后即刻给予 PDGF 50 ng/kg 腹腔注射，假手术组和对照组成模后即刻腹腔注射等体积的生理盐水。每组随机取 8 只大鼠于术后12、24、72 h 处死，取脑组织制备脑细胞悬液，双染法流式细胞仪检测脑细胞凋亡率。结果 假手术组各时间点神经细胞
2、凋亡率无明显差异(P0.05)，术后 12、24、72 h 对照组和治疗组神经细胞凋亡率均逐渐增加，差异有显著性(F=130.35、78.83，q=5.0719.46，P0.01);各时间点对照组和治疗组较假手术组脑细胞凋亡率显著增加，治疗组较对照组脑细胞凋亡率显著减少，差异有显著性(F=39.01194.20，q=3.0816.51，P0.01)。结论 PDGF 可通过减少神经细胞凋亡，发挥对新生鼠 HIBD 的神经保护作用。 【关键词】 缺氧缺血,脑;血小板源性生长因子;大鼠;流式细胞术;细胞凋亡 ABSTRACT Objective To explore the protection o
3、f platelet derived growth factor (PDGF) against hypoxicischemic brain damage (HIBD) in neonatal rats. Methods This study consisted of 72 Wistar rats of 7dayold, which were evenly randomized to shamoperation, treatment and control group. The rats in shamoperation group underwent only mobilization of
4、right common carotid (RCC); those in the treatment and the control, the RCC was mobilized and ligated and hypoxia for two hours to create a rat model of HIBD. The rats in the treatment were then offered intraperitoneal injection of PDGF 50 ng/kg. The rats in the shamoperation and control were given
5、the same volume of normal saline intraperitoneally. Eight rats in each group were taken and sacrificed at 12, 24 and 72 hours postoperatively. The brain tissue was collected for preparation of brain cell suspension, and cell apoptosis measured by flow cytometry. Results In shamoperation group, the d
6、ifferences of apoptosis of nerve cells in different time points were no significant (P0.05). The apoptosis rates in the treatment and control group, at 12, 24 and 72 after surgery, increased gradually, being significantly different (F=130.35,78.83;q=5.07-19.46;P0.01). The apoptosis rates in the cont
7、rol and the treatment were higher than that in the shamoperation (P0.01), and that in the treatment was lower than that in the control (P0.01). Conclusion PDGF may protect newborn rats from HIBD by reducing nerve cell apoptosis. KEY WORDS hypoxiaischemia, brain; plateletderived growth factor; rats;
8、flow cytometry; apoptosis 新生儿缺血缺氧性脑损伤(HIBD)是围生期新生儿窒息引起的脑损伤，严重者可留下神经系统后遗症，甚至威胁新生儿生命。目前治疗方法主要是支持和对症治疗，寻找对其有效的治疗药物成为目前研究的热点1。近年来的研究结果显示，血小板生长因子(PDGF)及其受体在中枢神经系统广泛表达，对神经元及神经胶质细胞的生长及发育发挥重要作用25 。本实验通过制备新生大鼠 HIBD 模型，早期给予外源性 PDGF 干预治疗，观察 PDGF 对新生大鼠 HIBD 神经细胞凋亡的影响，探讨 PDGF 对新生大鼠HIBD 的神经保护作用，以期为临床寻找新生儿 HIBD 新的
9、有效治疗措施提供实验依据。 1 材料和方法 1.1 实验材料 1.1.1 实验动物及其分组 选择新生 7 日龄普通级 Wistar 大鼠 72 只，雌雄不限，体质量为(18.342.45)g,由青岛市药品检验所实验动物中心提供。随机分为假手术组、治疗组和对照组，每组 24 只。 1.1.2 试剂与仪器设备 Human PDGFBB, 英国 PeproTech 公司生产，购自青岛晶旷生物科技有限公司，与大鼠的 PDGFBB 同源性为88%。AnnexinFITC 凋亡检测试剂盒，购自北京宝赛生物技术有限公司，混合气体购自青岛合利气体有限公司。BECKMAN COULTER FC500 流式细胞仪
10、，LD52A 离心机(北京医用离心机厂制造)，日本 OLYMPUS 荧光显微镜，200 目不锈钢细胞筛。 1.2 实验方法 1.2.1 新生大鼠 HIBD 模型制备 治疗组和对照组制备 HIBD 模型。取7 日龄 Wistar 大鼠腹腔注射 100 g/L 水合氯醛 3 mL/kg 麻醉后，仰卧固定于手术板上，用安尔碘局部消毒皮肤。于右侧颈动脉区作一长约 1 cm切口，逐层分离皮下组织，暴露并游离右侧颈总动脉，0 号线结扎右颈总动脉，一次性缝合线缝合切口。待术后苏醒将大鼠放入自制的新生大鼠缺氧装置中，以 2 L/min 的流量输入体积分数 0.08 O2+体积分数 0.92 N2 的混合气体，
11、环境温度为 3637 ,低氧处理 2 h 后取出返回母鼠身边继续喂哺。假手术组仅分离右侧颈总动脉，不予结扎及低氧处理。 1.2.2 干预措施 治疗组于模型建立后 30 min 内腹腔注射 PDGFBB 50 ng/kg，假手术组和对照组在相同时间腹腔注射等量生理盐水。 1.2.3 标本的制备 3 组大鼠分别于术后 12、24、72 h 以 100 g/L 水合氯醛过度麻醉处死，断头，取右侧大脑半球脑组织用生理盐水洗去表面血污，无菌剪刀将其剪成 1 mm3 小块，放到 200 目(相当于孔径 80 m)不锈钢细胞筛网上，用无菌玻璃试管挤压脑组织块，PBS 液轻轻吹打细胞网筛，滤过液再经 40 m
12、 细胞筛过滤，即成单细胞悬液。单细胞悬液再经过 PBS 液洗涤 12 次,取 1 mL 细胞(密度 5108/L1109/L)用 FITC和 PI 双染(方法参照 Annexin 试剂盒说明书), 40 g/L 多聚甲醛 23 mL 固定，4 避光保存。 1.2.4 细胞凋亡检测 采用流式细胞仪检测法: 将 40 g/L 多聚甲醛固定的单细胞悬液用冷的 PBS 液洗 12 次，用 PBS 液使细胞悬浮，即可上流式细胞仪检测细胞凋亡率,计数 104 个细胞。 1.2.5 统计学处理 数据以均数标准差表示。用 SPSS 12.0 统计软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析，P0.05 为差异有统
13、计学意义。 2 结 果 假手术组大鼠各时间点神经细胞凋亡率无明显差异(P0.05)，术后 12、24、72 h 对照组和治疗组神经细胞凋亡率均逐渐增加，差异有显著意义(F=130.35、78.83，q=5.0719.46，P0.01)。各时间点对照组和治疗组较假手术组脑细胞凋亡率显著增加，治疗组较对照组脑细胞凋亡率显著减少，差异有显著意义(F=39.01194.20，q=3.0816.51，P0.01)。见表 1。表 1 各组术后不同时间右侧大脑半球神经细胞凋亡率 3 讨 论 HIBD 极期对症支持治疗及随后的脑细胞代谢激活剂、促进神经纤维修复药物的应用已达成共识。针对发病机制的各个环节，国内
14、外学者对HIBD 的治疗作了大量的研究，如基因治疗、神经干细胞移植、氧自由基清除剂、钙离子通道阻滞剂和细胞因子的应用等，都尚在探索研究阶段。近年来，很多研究支持 PDGF 具有神经保护作用25 。 3.1 HIBD 与细胞凋亡 ZHANG 等6研究显示，缺血低氧后不成熟大脑室管膜下神经细胞发生不同程度的损伤。神经元和少突细胞祖细胞较神经干细胞和星形胶质细胞受损更为严重。临床及动物实验证明缺血低氧可引发细胞凋亡。细胞凋亡在 HIBD 中呈动态变化过程。神经细胞急性坏死的同时，凋亡即已发生，在缺血低氧后 4 d，细胞急性坏死减少或停止，凋亡仍然发生，直至 12 周以后7。细胞凋亡时细胞膜磷脂酰丝氨
15、酸(ps)外翻，ps 与荧光探针特异性结合，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测凋亡细胞。 3.2 PDGF 的神经保护作用 PDGF 是由多种细胞产生能刺激成纤维细胞、平滑肌细胞、胶质细胞等增生的多肽，具有广泛的生理活性。它是由 A、B 两条多肽链通过二硫键连接而成的同型或异型二聚体，包括 PDGFAA 、PDGFBB 、PDGFAB等 3 种形式，其相对分子质量为 2.8 万3.5 万。PDGF 生物学特征主要有分裂效应、缩血管活性和趋化活性，它以自分泌、旁分泌的方式发挥作用。PDGF 受体由 、 两种亚基构成 3 种二聚体，PDGF 发挥作用必须与靶细胞上的受体相结合。近年来的研究结果发现，
16、PDGF 及其受体在中枢神经系统广泛表达，它参与神经系统的发育、成熟等过程，在不同发育时期的神经元、神经胶质细胞均有表达，PDGF 在神经变性、脑缺血缺氧性损伤等疾病中发挥重要的作用。PDGF 及其受体在神经系统的表达受多种因素调节，在损伤、缺血低氧、炎症时表达增多811 。OHNO 等9研究结果显示，HIBD 诱导神经元的 PDGFBB 和 受体水平迅速升高，提示 PDGFBB 分子可能作为一种神经保护因子在大脑缺血缺氧性损伤中发挥作用。 PDGF 的神经保护作用机制可能为：PDGF 是体内较强的促有丝分裂剂和化学诱导剂，能促进神经元祖细胞分裂以及增加神经细胞的存活1214;PDGF 可以降
17、低神经元的兴奋毒性15;对抗自由基损伤16;减少神经细胞凋亡17;保护多巴胺能神经元3,18;调节神经胶质细胞分化8。 3.3 PDGF 与神经细胞凋亡 CHENG 等16报道，体外培养 PDGF 发挥神经保护作用的浓度为3100 g/L，OTHBERG 等3研究认为 30 g/L 最佳。本实验为体内实验，用药剂量参照体外实验，新生鼠平均体质量为 20 g,按液体量占体质量 80%计算，50 ng/kg 接近 30 g/L。本实结果表明，适度缺血低氧可诱导神经细胞凋亡， PDGF 能减轻缺血低氧新生大鼠神经细胞凋亡，证实了它的神经保护作用，为 PDGF 治疗 HIBD 提供了动物实验依据。至于
18、达到最佳效果的 PDGF 的用量和疗程，PDGF 治疗 HIBD 的副作用还有待于进一步研究。 【参考文献】 1郑湘榕,张珊珊,尹飞,等. 腺病毒载体介导血管内皮生长因子 165基因治疗新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的研究J. 中华医学杂志, 2009,89(2):128132. 2GIACOBINI M M J, SMITS A, FUNA K, et al. Differential effects of plateletderived growth factors on fetal hippocampal and cortical grafts: evidence from intraocul
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