1、血浆循环核酸 p53 突变诊断原发性肝癌的价值作者：汪海丹，斯晓明，吕韶敏，任军 【关键词】 癌 关键词: 癌，肝细胞;基因 p53;突变;核酸类;血浆 摘 要:目的 研究肝脏良恶性疾病患者血浆循环核酸 p53基因突变，探讨其突变检测诊断肝癌的可行性和价值. 方法 肝脏疾病患者 61例，其中原发性肝癌 36例，良性组为肝血管瘤、肝囊肿和乙型肝炎肝硬化患者共 25例，提取血浆 DNA，采用 PCR扩增 p53基因外显子 56，7和 8（E56，E7 和 E8） ，用变性高效液相色谱法（DHPLC）对产物进行突变筛选. 结果 肝恶性肿瘤患者 36例血浆提取的 DNA扩增出E56，E7 和 E8例数
2、分别为 10，36 和 35，良性组对应为 0，6 和 4例.DHPLC 检测到 4/36例 E56突变，12/36 例 E7突变，未检测到 E8突变，良性组检测到 2/25例 E7突变. 结论 良恶性组间扩增阳性率有明显差异（P0.05） ，p53 基因突变与乙型肝炎感染有关，HBsAg+ 肝癌患者 p53基因突变率明显高于 HBsAg- 肝癌患者（P0.05） ，循环核酸 p53突变检测有望成为肝癌高危人群特别是乙型肝炎感染和携带者预警或早期诊断的参考指标. Keywords:carcinoma，hepatocelluar;genes，p53;mutation;nucleic acids;
3、plasma Abstract:AIM To detect p53gene mutation in plasma DNA from cases with hepatic diseases，to explore a new method for tumor diagnosis or monitoring.METHODS 36hepato-cellular carcinoma（HCC） （20HBsAg+ ） ，21HBV hepatitis/cirrhosis and4other benign liver disease patients were en-rolled in the resear
4、ch.DNA was extracted from plasma by using Qiagen Blood Kit and the target DNA fragments（Exon56，7and8）were amplified by PCR.The production was an-alyzed by denaturing high performance liquid chromatography（DHPLC）.RESULTS Ten of E56，36of E7and35of E8were amplified from36HCC and0，6and4corresponding to2
5、5benign liver disease patients.16（12of E7，4of E56）and2mutation（2of E7）were detected by DHPLC from HCC and hepatitis/cirrhosis respectively.Two HCC patients had2mutation，and12（including10HCC）of16mutation patients were HBsAg+ .CONCLUSION Plasma DNA can be amplified more frequently in HCC.Small target
6、fragment（200bp）is more efficient，which may be caused by poor plas-ma DNA.DHPLC can be used to screen mutation in plasma DNA amplified fragements.p53gene mutation can be found in hepatitis/cirrhosis but more frequently in HBsAg+ HCC（P0.05）. 0 引言 早在 1977年就有研究发现恶性肿瘤患者血浆中 DNA含量显著增高.近年国外一些研究证实，在乳腺癌、恶性黑色素
7、瘤血浆 DNA存在癌/抑癌基因突变、启动子甲基化和微卫星改变，并发现通过有效治疗，肿瘤负荷减轻后，其血浆 DNA可减低，甚至消失.因此，血浆 DNA对肿瘤的诊断、治疗和预后评估都可能有重要价值1，2 .目前认为，p53 基因突变与大多数肿瘤发生密切相关，因此我们抽提肿瘤和良性疾病患者血浆 DNA，通过 PCR扩增 p53基因突变频率较高的外显子 56，7 和 8，再采用变性高效液相色谱技术（DHPLC） ，参考 Atencio等3 的方法对产物进行突变分析，旨在探讨循环核酸 p53基因突变检测对肝癌的生物学行为估计和对其诊断治疗的参考价值. 1 材料和方法 1.1 材料 肝癌血浆标本 36（男
8、 23，女 13）份来自 2000-07/2001-09西京医院住院患者，全部经病理确诊为原发性肝癌，其中 HBsAg+ 20例，年龄 2782（平均 45.3）岁.肝炎肝硬化 21例（全部 HBsAg+ ）和其他良性肝疾病 4（肝血管瘤和肝囊肿各 2）例，来自第四军医大学唐都医院感染病科和西京医院住院患者.PCR 阳性对照为正常胃粘膜组织DNA.DNA提取试剂盒购自 Intergene公司（Qiagen Blood Kit，Germany）p53E56，7 和 8引物根据 GenBank检索结果参照文献4设计，由 TaKaRa公司合成，序列分别如下:E56（408bp）:t-Sense5-T
9、TCCTCTTCCTGCAGTACTTC-3t-AntiSense5-AGTTGCAAACCAGCCTGAGG-3E7（133bp）:t-Sense5-TCTCCTAGGTTGGCTCTGAC-3t-AntiSense5-CAAGTGGCTCCTGACCTGGA-3E8（193bp）:t-Sense5-CGTCAAGACTTTTCCTATCCTG-3t-AntiSense5-CGGTCGACCTTCTTGTCCTGC-3PCR使用 DNA扩增试剂盒（美国 Promega公司产品）和 PTC-200智能型热循环仪（美国 MJ Research，Inc 产品） ，琼脂糖以及核酸分子质量参照物 10
10、0bp DNA梯度购自华美生物工程公司. 1.2 方法 于清晨用 EDTA-K2抗凝管采患者空腹时静脉血 3mL，立即3000g离心 15min，取血浆于-20冰箱保存或即刻提取 DNA.DNA提取步骤参照试剂盒说明.PCR 扩增反应体系为 25L，循环条件为:9530s，55（E7 和 E8分别为 59和 56）30s，7245s，重复循环 35次，最后于 72延伸反应 10min.取 PCR反应产物 5L 于 20gL-1 琼脂糖凝胶电泳（含 EB5mgL-1 ） ，5Vcm-1 恒压电泳，紫外灯下观察结果后照像5 .DHLLC筛选突变采用美国 Transgenomic公司 WAVETM
11、DNA片段分析系统，色谱柱为 DNASepR 分析柱，自动进样，每份产物进样 10L.样品在各自最佳变性温度和洗脱条件（由软件据核苷酸序列生成）下按点突变方式分析7 . 2 结果 36 例肝癌患者中扩增外显子 56，7 和 8阳性者分别为 10，36和 35例，而良性疾病组对应为 0，6 和 4例（可扩增出片段 6例，其中4例同时扩增出 E7和 E8）.DHPLC 分析扩增产物表明，HCC 有 16例突变（4 例 E56，12 例 E7，无 E8） ，良性病组仅有 2例 E7突变（Fig1，2）. 图 1 图 2 略 3 讨论 肝癌的早期诊断和高危人群的监测尚缺乏简便可行的方法和指标6 .p5
12、3基因是一种重要的抑癌基因，许多肿瘤组织中 p53蛋白都为突变型且过表达7 ，但这种检测是手术后进行的，有人发现某些肿瘤患者血清中存在 p53抗体，在各种肿瘤患者中阳性率可达 13%46%，因敏感性稍好被认为具有较大的临床价值8，9 .突变是肿瘤发生早期的分子事件，大多数研究支持检测基因水平的改变对肿瘤的早期诊断具有重要意义10 .近年发现，肿瘤患者血清中核酸浓度明显升高，因此循环核酸的检测要远早于影像学等改变.循环核酸水平与患者肿瘤负荷有关，循环核酸检测有望应用于恶性肿瘤患者的治疗效果评价和预后估计. 我们发现，恶性肿瘤患者血浆 DNA扩增阳性 36/36，明显高于对照组6/25（P0.05
13、）.对于良恶性组不同片段间扩增阳性率 2 检验表明，E56阳性率明显低于 E7/E8，而 E7与 E8间则无统计学差异.这种差异可能由于循环核酸模板片段较小，而本研究中 E56长度为408bp，从而影响了有效的扩增.肝癌中 E56突变率为（4/10） ，加之 E5和 E6位于同一片段内，其中可能有内含子的变异，故其外显子突变率应低于此，对此须进一步作测序分析;而对于 E7恶性组 36例筛选出了 12例突变（33.3%） ，这一结果较组织切片的 40%50%要低11 ，但远较良性组 8%高，两组中 E8均未检测到突变存在.所有突变的 16例中有 13例 HBsAg+ ，占本研究中 41例 HBs
14、Ag+ 的 31.7%，另外 20例非HBsAg+ 则只有 15%（3/20） ，提示乙型肝炎病毒感染有促突变作用4 .HB-sAg+ 肝癌患者 p53突变率更高，达 55%（11/20，其中 2例 2处突变），明显高于 HBsAg- 肝癌者（18.8%，P0.05）.所以 HBsAg+ 人群 p53突变检测可望成为临床辅助诊断的新方法和乙型肝炎感染者预后的一个参考指标. 参考文献: 1Esteller M，Sanchez CM，Rosell R，Sidransky D，Baylin SB，Herman JG.Detection of aberrant promoter hypermethyl
15、ation of tumor suppressor genes in serum DNA from non-small cell lung cancer patients J.Cancer Res，1999;59（1）:67-70. 2Wong IH，Lo YM，Zhang J， Liew CT，Ng MH，Wong N，LaiPB，Lau WY，Hjelm NM.Detection of aberrant p16methyla- tion in the plasma and serum of liver cancer patients J.Cancer Res，1999;59（1）:71-7
16、3. 3Atencio DP，Iannuzzi CM，Green S，Stock RG，Bernstein JL，Rosenstein BS.Screening breast cancer patients for ATM muta-tions and polymorphisms by using denaturing high performance liquid chromatography J.Environ Mol Mutagen，2001;38（2-3）:200-208. 4Zhu MH，Greenblatt MS，Feitelson MA.Relationship between
17、hepatitis B virus associated primary hepatocellular carcinoma and alteration of tumor suppressor gene p53J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ） ，1998;19（3）:314-317. 5Han SS，Cooper DN，Upadhyaya MN.Evaluation of denaturing high performance liquid chromatography（DHPLC）for the mu-tational ana
18、lysis of the neurofibromatosis type1（NF1）gene J.Hum Genet，2001;109（5）:487-497. 6Li J，Wang WL，Li YS，Liu B.TUNEL assay oif apoptosis in human hepatocellular carcinoma under laser confocal microscope J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ） ，1999;20（2）:102-105. 7Wang AH，Zhang HY，Wang Y，Yan MX，
19、Sun CS，Li LS，Huang JY，Cheng QS，Zhu YF.Molecular epidemiological study on esophageal cancer in Xian J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ） ，2001;22（1）61-63. 8Ren J，Chen Z，Juan SJ，Yong XY，Pan BR，Fan DM.Detec-tion of circulating gastric carcinoma-associated antigen MG7-Ag in human sera using
20、 an established single determinant immuno-polymerase chain reaction technique J.Cancer，2000;88（2）:280-285. 9Takeda A，Shimada H，Nakajima K，Yoshimura S，Suzuki T，Asano T，Ochiai T，Isono K.Serum p53antibody as a useful marker for monitoring of treatment of superficial colorectal ade-nocarcinoma after end
21、oscopic resection J.Int J Clin Oncol，2001;6（1）:45-49. 10Mayall F，Fairweather S，Wilkins R，Chang B，Nicholls R.Mi-crosatellite abnormalities in plasma of patients with breast carci-noma:Concordance with the primary tumour J.J Clin Pathol，1999;52（5）:363-366. 11Zhang HL，Wang W，Hu LZ.Detection of the mutations of p53and K-ras genes and their expression products J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（ J Fourth Mil Med Univ） ，1999;20（9）:769-771.
