1、阳极损毁海马腹侧下托可减少成瘾大鼠的条件位置偏爱【关键词】 条件位置偏爱；海马；电解损毁；吗啡依赖；药物渴求【Abstract】 AIM: To investigate whether the ventral subiculum (VSUB) lesions can release the drug craving from drug addicted rats. METHODS: Female SD rats were trained to acquire the morphine conditioned place preference (CPP). After the preferenc
2、e was established, the rats were divided to 3 groups. The lesion group (n=20) received the electrolytic lesions of VSUB, the sham lesion group (n=10) received the same operation to the lesion group but no current passed, and the control group (n=10) received no operation. After 5 d recovery, the 3 g
3、roups underwent the CPP testing again to observe the extent of drug craving. RESULTS: A histological test was performed on postlesion rats after a behavioral test, and the lesions were found confined to the VSUB. The time that the lesion group spent in the drugpaired side was significant decreased (
4、93.126.0) s compared with both sham group (10.14.5) s and control group (5.14.1) s. (P0.05). CONCLUSION: The VSUB play an important role in drug addiction and lesions of the exact part can release the drug craving from drug addicted rats.【Keywords】 conditioned place preference(CPP); hippocampus; ele
5、ctrolytic lesions; morphine dependence; drug craving【摘要】 目的： 研究损毁腹侧海马下托（VSUB）是否能够阻止成瘾大鼠的条件位置偏爱. 方法： 雌性 SD大鼠，经过吗啡强化训练使其形成条件位置偏爱（CPP）. CPP形成并稳定之后，将大鼠分成 3组： 损毁组 20只，接受双侧 VSUB的直流电损毁；假手术组 10只，接受与手术组相同的手术操作，但不通电流；空白对照组 10只，不作任何处理. 经过 5 d的恢复，3 组大鼠再次测定 CPP 时间，确定其药物渴求的程度. 结果： 行为学测试结束后，将样本灌注切片进行组织学评定，损毁组脑片组织缺
6、损位置局限于 VSUB区域. 损毁组大鼠伴药箱停留时间明显减少(93.126.0) s ，相对于假手术组(10.14.5) s和空白对照组(5.14.1) s的大鼠在伴药侧停留的时间减少量有显著性差异（P0.05）.结论： VSUB 在大鼠对药物的渴求中起着非常重要的作用，损毁该部位可以阻止成瘾大鼠的条件位置偏爱.【关键词】 条件位置偏爱；海马；电解损毁；吗啡依赖；药物渴求0引言药物依赖是一种伴有心理的和神经生物学表现的慢性大脑功能紊乱. 大多数吸毒的患者都会在戒毒治疗（消除了身体依赖症状）一段时间后由于心理依赖的驱使而复吸. 大鼠与人有着相似的复吸机制，主要有药物引燃、心理应激、伴随药物的条
7、件刺激（例如熟悉的环境和人等）. Vorel等1在实验中以 Theta 波刺激海马腹侧下托（ventral subiculum, VSUB）可以诱发大鼠的药物渴求，这一发现提示了 VSUB在复吸发生中具有重要作用. 本实验采用条件位置偏爱（conditioned place preference, CPP）时间作为衡量大鼠将药物作用与环境相联系的指标2-3 ，通过对比 VSUB损毁前后大鼠偏爱时间的变化，探讨 VSUB在吗啡依赖形成过程中的作用.1材料和方法1.1材料成年雌性 SD大鼠 40只， 体质量 220250 g（由第四军医大学试验动物中心提供） ；大鼠立体定向手术固定头架（日本成茂公
8、司SR5） ；有恒流输出的刺激器、隔离器、损毁电极（不锈钢材质，直径 0.2 mm，涂覆绝缘漆，尖端裸露 0.5 mm） 、吗啡粉剂（青海制药厂生产，使用前以蒸馏水溶解配制成 1 g/L的溶液）. 按文献4的方法，大鼠的位置偏爱箱包括 A, B, C三个独立的箱体， 各箱体内地板材质及墙壁颜色图案均不相同. 两个箱中均装有自动计时装置，当动物进入其中时，连接在箱外的计时器开始计时，累加动物在其中所处的时间，同时计数器会增加一个数值，累加动物进入的次数，避免人为计时计数的误差.1.2方法1.2.1地点偏爱的建立大鼠实验前先单独饲养于笼中，光照时间从上午 8时至晚 8时模拟正常昼夜交替（12 h/
9、12 h）. 每日进行 4次适应性抓握，两日后正式开始训练.训练分 前测试阶段： 测试大鼠的自然偏爱，将有天然偏爱的大鼠从样本中剔除. 测试时升起通道隔板，使三箱连通，大鼠从 B箱放入，开启自动计时装置，记录 15 min内大鼠在 A, C两箱内分别停留的时间以及穿越次数. 测试期间，保证箱内光线、气味的一致以及周围环境的安静. 测试结果记录成表. 根据此阶段的测试结果，选择两侧偏爱时间相差100 s的大鼠进入下一阶段. 训练阶段： 用隔板封闭两箱间通道. 每只大鼠于上午 9时和晚 8时各进行 1次皮下注射. 其中 1次注射吗啡（10 mg/kg） ，另 1次注射生理盐水 0.3 mL. 注射
10、吗啡后大鼠放入 A箱，注射生理盐水后大鼠放入 C箱，均在箱中停留 40 min. 重复训练 7 d. 测试阶段，操作与第阶段所述相同，白箱时间增加值100 s则认为动物产生了明显的偏爱，低于此值者不入选样本. 穿越次数低于 20次的动物，说明运动不活跃，CPP 测量值误差较大，该动物剔除出样本.1.2.2动物分组将已经建立地点偏爱的大鼠完全随机分配至三个试验组. 损毁组（20 只） ；假手术组（10 只） ，只将电极插入，不做损毁；空白对照组（10 只） ，不做任何处理，笼养 5 d.1.2.3阳极损毁大鼠 10 g/L戊巴比妥钠腹内注射（50 mg/kg） ，麻醉后固定于立体定向仪上，门齿杆
11、位于耳间线下方 3.3 mm，双侧 VSUB颅骨表面投影点钻孔，将损毁电极依照大鼠脑立体定位图谱下至靶点，双侧坐标以 Bregma为原点， AP -6.3 mm, ML 5.2 mm, DV -7.2 mm5 ，通直流电进行损毁，电极接直流电源阳极，电流（1 mA） ，通电时间 30 s，完成后取出电极，缝合. 全部手术均保证无菌操作，防止动物发生感染. 动物术后恢复 5 d，之后进行行为测试.1.2.4术后地点偏爱测试与前述的地点偏爱测试方法相同，分别测试每只大鼠在 A, C两箱的停留时间，记录成表.1.2.5组织学检查测试完成后，损毁组及假手术组大鼠在戊巴比妥钠深度麻醉下以生理盐水，10
12、g/L多聚甲醛混合 10 g/L亚铁氰化钾，40 g/L多聚甲醛 PBS溶液的顺序依次灌注，取脑，做冰冻切片（冠状，片厚60 m） ，尼氏染色观察损伤范围.统计学处理： CPP测量结果以训练前后以及手术前后的白箱时间改变值作为统计量，数据处理使用 SPSS10.5软件，采用配对 t检验及单因素方差分析(Oneway ANOVA)，显著性水平取 0.05.2结果2.1组织学评定采用双盲法，由第三人在显微镜下观察神经缺损范围，将损毁位置不准确或损毁区域过大过小的个体从样本中去除. 损毁位置组织学观察： 损毁组损毁范围较准确的局限于双侧 VSUB区域内，损毁区内神经元及周围组织包括路过的纤维均已变性
13、坏死，形成空洞，空洞周围组织镜下未见异常. 这样的损伤在以 Bregma为原点，AP 5.80 mm7.02 mm范围内均能被观察到. 假手术组仅见针道附近轻微损伤，VSUB区域除针道外并无明显改变（图 1）.图 1腹侧海马下托损毁范围组织学检查2.2CPP测试大鼠在 7 d的训练完成后，测定一次术前偏爱，各组大鼠在白箱停留时间增加值为(169.023.2) s，经检验，P0.001，说明 CPP已经形成. 在手术损毁 VSUB后，CPP 时间较术前有明显改变. 损毁组白箱停留时间减少值为(93.126.0) s, 而假手术组的伴药侧停留时间减少值为(10.14.5) s，空白对照组伴药侧停留
14、时间减少值为(5.14.1) s. 经单因素方差分析，各组间有显著差异，F=7.877，P=0.001. 以 LSDt检验再作组间两两比较，损毁组与假手术组（P0.01） ，损毁组与空白对照组（P0.001）均有显著差异，而假手术组与空白对照组（P=0.42）没有显著差异. 以上结果说明阳极损毁 VSUB可以降低大鼠对吗啡的条件位置偏爱.3讨论本实验观察到手术损毁 VSUB对于抑制吗啡成瘾大鼠的位置偏爱有着明显的作用，并且从另一个角度支持边缘系统的谷氨酸能神经元在复吸表达中的重要作用. 条件位置偏爱是用来衡量药物奖赏作用的一项指标2. 药物心理依赖的形成过程，是给药激活奖赏环路产生欣快感形成顽
15、固记忆的过程. VSUB是海马重要的输入输出结构，与许多脑区既有传入又有传出纤维的联系，这些脑区有些与奖赏环路关系密切，有些则是大鼠感受外界信息的主要传入部位. Vorel等1发现刺激VSUB区可诱发大鼠的药物渴求，在本实验中损毁 VSUB区会使大鼠对伴药侧的偏爱程度明显减轻，提示 VSUB在药物渴求的产生中起着重要作用. 另外 Meyers等6发现损伤海马的背侧可以抑制 CPP的形成，而损伤腹侧则作用不明显，说明海马的背侧相对于腹侧更多参与了药物成瘾的获得过程. 上述研究提示海马作为学习记忆环路中的一环，不管是在药物渴求的形成过程还是药物渴求的发生中，都起着极其重要的作用.对于防止复吸而言，
16、阻止药物渴求的表达是关键. 阻止渴求表达有两种途径，一是去除有关渴求的记忆内容，另一个就是阻断渴求记忆的提取表达过程. 实验虽然证明了大脑是将用药感受的记忆和对药物的渴求单独存放在一个区域的，但对药物渴求的记忆究竟存储在哪里？它是与其他记忆混合存放还是单独储存？现在都还没有很确实的研究结论，所以第一种途径就无法实现7. 而环境暗示所诱发的渴求的表达，海马及 VSUB可能参与其中. 损毁这个环节，使渴求无法提取并表达，就能起到阻止复吸，戒除心理依赖的效果. 普通遗忘是因为大脑提取机制暂时失效引起的，而损毁 VSUB阻止渴求表达却是永久的，不可恢复的. 相对于平时的遗忘，这种损毁所引起的结果对于消
17、除渴求防止复吸来说正是我们希望得到的.当然，对于 VSUB的功能，一定不仅仅限于是药物渴求的提取通路，我们的实验所能说明的可能只是其许多功能中的一种. 鉴于海马在学习记忆中的重要作用和不可替代的位置，单纯观察损毁 VSUB对药物渴求的影响是远远不够的. 损毁 VSUB会有较严重的副作用么？这种损伤究竟对大脑功能有多大影响？这种影响相对于滥用药物引起的危害究竟谁轻谁重，还需要进一步深入探讨，也是决定该方法能否作为一种治疗方法的关键. 这些问题我们将在今后的工作中进一步研究.【参考文献】1 Vorel SR, Liu XH. Relapse to cocaineseeking after hipp
18、ocampal theta burst stimulation J. Science, 2001,292:1175-1178.2 Bardo MT, Bevins RA. Conditioned place preference, what does it add to our preclinical J. Psychopharmacology, 2000,153:31-43.3 Herzig V, Schmidt WJ. Repeatedtesting of place preference expression for evaluation of anticravingdrug effec
19、ts J. Amino Acids, 2005,28(3):309-317.4 王庆丰,高国栋. 伏隔核的外壳部和核心部毁损对大鼠吗啡觅药行为的影响J. 第四军医大学学报,2003,24（9）:773-775.5 Paxions G, Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates M. 1998 San Diego, CA: Academic Press.6 Meyers RA, Zavala AR, Janet L. Dorsal, but not ventral, hippocampal lesions disrupt cocaine place conditioning J. Neuroreport, 2003,14:2127-2131.7 Holden C. Zapping memory center triggers drug craving J. Science, 2001,292:1039.
