1、异种骨髓移植后 1 例慢性移植物抗宿主病动物模型的观察作者：王晓武 蔡振杰 胡军 何显力 胡巧侠 【关键词】 骨髓移植 关键词: 骨髓移植;移植，异种嵌合体;移植物抗宿主病 摘 要:目的 探讨异种造血嵌合体模型中慢性移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GVHD）发生的特点及机制. 方法 本研究对 40 余只异种造血嵌合体模型中出现的一只慢性 GVHD 实验兔行血常规、肝功、骨髓涂片检查，对其肝、肺、小肠、皮肤等脏器行常规病理、胶原纤维染色等检查，并同时用 PCR 测其外周血中供体细胞嵌合情况. 结果 该实验兔外周全血细胞减少，PCR 检查未发现供体细胞，骨髓轻度
2、增生不良;病理结果显示其病变仍以皮肤为重但均较同种 GVHD 轻，其病变侵犯部位与同种 GVHD 无明显区别. 结论 异种骨髓移植的慢性 GVHD出现时间晚，较罕见，临床表现不如同种慢性 GVHD 典型，病变较同种GVHD 轻;其病变侵犯器官与同种 GVHD 无明显区别. Keywords:bone marrow transplantation;transplantation，heterologous chimera;graft vs host disease Abstract:AIM To explore the feature and mechanism of oc-currence of
3、 chronic GVHD in heterogeneous hemopoietic chimera model.METHODS In the experiment，of40or so heterogeneous hemopoietic chimera models，one rabbit suf-fered from chronic GVHD，to which blood routine examina-tion，liver function test and bone marrow smear examination were conducted，and routine pat hologi
4、c and collagenous fiber staining examinations were performed to its liver，lung，small intestine and skin，and meanwhile engomphosis of cells in peripheral blood was determined by PCR.RESULTS Pe-ripheral whole blood cells of this experimental rabbit re-duced，and by PCR，no donors cell was found，and slig
5、ht defective profileration of marrow occurred;the pathologic re-sults showed that its pathological processes mainly occurred in its skin and were all slighter than homogenic GVHD，and there was no obvious difference in the invaded regions be-tween heterogenic and homogenic GVHD.CONCLUSION The chronic
6、 GVHD of heterogenic marrow occurs at late stage and is rare，and it is not as typical as homogenic chronic GVHD in the clinical performance，and slighter than ho-mogenic GVHD in pathological process;there is no obvious difference between heterogenic and homogenic GVHD in the invaded region. 0 引言 由于异种
7、造血嵌合体的建立较困难及供体细胞在受体体内的嵌合时间较短等原因，很少出现慢性移植物抗宿主病.我们把大鼠的胸腺、骨髓联合移植给经去脾、去胸腺、环磷酰胺等预处理的受体兔后，成功建立了 40 余只大鼠兔的异种造血嵌合体模型，通过免疫荧光方法等检测，证明在受体兔体内有较高比例的大鼠细胞嵌合，嵌合时间超过240d1，2 .但大鼠细胞嵌合比例最高的实验兔（在移植后 45d 时大鼠细胞比例达 61.9%）于移植后 13mo 出现消瘦（未加注意） ，15mo 时出现极度消瘦，经专家检查排除了兔自然疾病的可能并认为与实验有关，将该兔命名为 1 号实验兔.为了解异种移植物抗宿主病（graft-versus-hos
8、t disease，GVHD）与同种 GVHD 在病理学及发生机制方面的区别，随对其进行了全面检查. 1 材料和方法 1.1 动物 供体为 Wistar 大鼠，雌性，体质量 200250g;受体为雄性新西兰兔，45mo 龄，均由第四军医大学实验动物中心提供. 1.2 方法 抽取 1 号实验兔外周血行各项生化检查，然后处死，取肝脏、肺、小肠、皮肤行病理学检查.血常规检测 经兔耳中央动脉抽血、抗凝，行常规检查，隔日 1 次，连做 2 次.肝功能检查 经兔耳中央动脉抽血，制备血清，行肝功能检查，隔日 1 次，连做 2 次.骨髓检查 无菌操作，从兔后肢胫骨上段穿刺抽取骨髓，常规涂片行 WG 染色检查.
9、HE 染色检查 取肝脏、肺、小肠、皮肤，甲醛固定，脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、常规 HE 染色.胶原纤维染色（VG 染色法）检查 取肝脏、肺、小肠、皮肤，同方法常规制片铁苏木精染色 5min盐酸乙醇分化VG 液染色 5min分化、脱水、封片.结果判定:胶原纤维呈红色，肌纤维、胞质、红细胞呈黄色，细胞核呈蓝黑色.肝糖元染色检查 取肝脏，同方法常规制片明矾苏木精染色 5min盐酸乙醇分化Best 胭脂红液染色 3040minBest 分化液分化脱水、封片.结果判定:糖元颗粒呈红色，核呈蓝色.PCR 检查 取外周血分离单个核细胞，提取细胞 DNA，以大鼠 Alu 序列的 5端与 3端序列为模板合成
10、一对引物，引物 1 序列:5-CATGTGTGGCTTGG-TTTATTGAG-3;引物 2 序列:5-TGAGTCCAGG-TCCTGCAGAACCC-3.大鼠 Alu 序列为 319bp. 2 结果 2.1 一般情况 兔体质量由移植后初期的 3.5kg 减至处死前的2.1kg，但无脱毛及腹泻等症状.处死后见其肝脏甚小，仅有 25g（2.1kg兔肝脏应重 50g 左右） ，其肠壁甚薄. 表 1 1 号实验兔外周血常规检查结果 略 2.2 血常规检查 与正常值对照，其全血细胞减少，嗜酸、嗜碱性细胞比例增加，并有较高比例的溶解样 细胞出现（一般认为该细胞出现与免疫反应有关） ，结果见 Tab1.
11、 2.3 肝功能检查 与正常兔肝功能结果相比，血清丙氨酸氨基转移酶（ALT） 、血清天门冬氨酸氨基转移酶（AST）及血清总胆红素（TBIL）轻度增高，余检查结果正常（Tab2） ，说明此实验兔肝功能轻度异常. 表 2 1 号实验兔肝功能检查结果 略 2.4 骨髓涂片检查 骨髓轻度增生不良，退行性变细胞多见（Fig1） ，粒细胞系统分叶核细胞比例增高，其他各阶段细胞比例均减低，可见嗜酸、嗜碱细胞.红细胞系统早、中、晚幼细胞比例未见异常.骨髓小粒中可见非造血细胞团，其大部分为网状细胞、吞噬细胞及退行性变细胞等. 2.5 HE 染色检查 肝脏显示肝小叶结构不清，中央静脉少见（Fig2） ，汇管区周围
12、有较多细胞浸润，肝小叶内有嗜酸细胞浸润（Fig3） ，未见肝硬化及纤维化表现.皮肤显示皮下明显水肿，皮下细胞及附件明显减少，甚至消失，毛囊上皮细胞部分变性，毛囊内可见透明样变，其周围有淋巴细胞浸润且核不规则.十二指肠可见少量淋巴细胞浸润，纤维母细胞增多，局部肠粘膜萎缩，肠腺减少甚至消失.肺脏肺泡壁增厚，局部出现实变，有较多嗜酸及淋巴细胞浸润. 2.6 胶原纤维染色（VG）检查 肝脏汇管区可见少量纤维组织，肝小叶内偶见胶原纤维.小肠粘膜下固有层胶原纤维增生，肺脏局部胶原纤维可见.皮肤明显纤维化，皮下疏松结缔组织结构消失，完全被增生的胶原纤维所取代，皮肤仅余一层表皮细胞，皮下细胞及附件明显减少，甚
13、至消失（Fig4）. 2.7 肝糖元染色检查 与正常兔相比，该实验兔肝细胞内几乎无糖元贮存（Fig5）. 2.8 PCR 检测 90d 实验兔和大鼠均扩增出一个和已知大鼠 Alu 序列大小一致的片段，但在 1 号实验兔和阴性对照兔均未扩增出阳性片段（Fig6）. 图 1 图 5 略 3 讨论 GVHD3-5 是同种骨髓等造血干细胞移植后，由于供受体之间存在着免疫遗传学差异，移植骨髓的免疫活性细胞（主要是 T 细胞）在受体内攻击受体靶组织，使受体发生的一种全身性疾病.GVHD 是同种骨髓移植的一种特有的常见并发症，其发生率高且病情较重，是影响骨髓移植疗效的主要因素之一，是导致移植失败、患者死亡的
14、重要原因.但在异种骨髓移植时由于供受体间巨大的遗传学差异，导致异种造血微环境中受体细胞因子、粘附分子及其他重要分子对异种供体细胞的不匹配，这些活性分子的种属特异性为受者造血细胞提供了合适的生长环境，而使异种供者造血细胞生长繁殖受到限制6 .有人报道这种供受体间的不匹配导致了异种骨髓移植与同种异体骨髓移植之间在各方面均出现明显差别7 .异种骨髓移植 GVHD 的发生率明显较同种骨髓移植低.Mosier8 将（25）107 个人外周血淋巴细胞移植给 SCID 鼠，800 只中仅 8 只发生 GVHD.Hoffmann-Fez-er 等9 也发现类似现象.我们建立 40 余只大鼠兔异种造血嵌合体模型
15、中仅 1 例发生 GVHD，也说明了这一点，但我们对异种骨髓移植后的动态病理观察发现10 :在我们的异种造血嵌合体模型建立过程中，移植物抗宿主反应（graft-versus-host reaction，GVHR）一直在受体体内发生着，只是 GVHR 较轻，未导致受体出现 GVHD 的症状，同时发现随着时间推移，其 GVHR 反应逐渐减弱，似乎表现为一种自限性疾病;异种 GVHD 较同种 GVHD 出现得晚;异种供体细胞在受者体内的浸润程度及分布部位均不同于同种 GVHD.远缘异种 GVHD 病变部位主要位于淋巴造血组织及供者淋巴母细胞扩增的部位11 ，而同种 GVHD 病变主要发生在复层鳞状上
16、皮被覆或由腺上皮构成的器官;同种 GVHD 中一些最易受累的器官在远缘异种 GVHD 中却很少受损或不受损等.从我们建立异种造血嵌合体模型的研究中也体会到，异种骨髓移植发生 GVHD 的情况是很少的，发生慢性 GVHD 的模型就更加罕见. 图 6 略 该实验兔在异种骨髓移植 13mo 后的其临床症状、各项化验及临床病理学检查结果均证实该兔患有慢性 GVHD.从各器官的病理学检查结果及以前的报道10 显示皮肤、肝脏、小肠等同种 GVHD 易波及的部位均出现了慢性病理改变，但病变较轻，并未发现异种骨髓移植后 GVHD 损害的好发或不好发部位.比较该模型各器官病变的严重程度，发现仍以皮肤纤维化病变明
17、显.结合我们以前的报道，认为在异种骨髓移植后对皮肤的动态病理观察仍可作为观察 GVHR 或 GVHD 发生的一个指标.从本例慢性 GVHD的临床表现看，它除长期缓慢消瘦外并无腹泻、腹部脱毛等其他在同种GVHD 中常见的特征性临床表现，这也许是异种骨髓移植后慢性 GVHD 与同种异体骨髓移植后慢性 GVHD 的不同点之一. 本模型中移植后不再使用任何免疫抑制剂，其慢性 GVHD 在 13mo 后才出现，结合其较轻的病理改变，说明通过胸腺、骨髓联合移植的方法建立异种造血嵌合体模型是一种较适合于临床应用的成功方法.若早日使用免疫抑制剂可能避免或大大推迟该模型中慢性 GVHD 的发生.从对该模型外周血
18、有核细胞 DNA 的 PCR 检测结果看，发生慢性 GVHD 时，其外周血中已无供体细胞存在.目前认为溶解样细胞出现是由于受体体内不断产生的少量抗细胞抗体与细胞表面抗原结合后激活补体造成细胞膜损伤，但又不足以使其溶解所致，淋巴细胞、中性粒细胞等都可成为其来源.这些发现是否说明异种骨髓移植后慢性 GVHD 的发展可不依赖供体免疫活性细胞的存在?异种骨髓移植导致受体内环境紊乱所致的自身免疫性疾病是否为该模型慢性 GVHD 发生和发展的重要原因等，还需进一步的验证. 参考文献: 1Hu J，Cai ZJ，Wang XW，Hu XL，Guan DL，Hu QX，Ma WY.Establishment
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