1、淫羊藿总黄酮对金属离子刺激单核细胞分泌肿瘤坏死因子的影响【摘要】 目的 通过观察淫羊藿总黄酮(total flavones of Epimedium, TFE)对金属离子(Co2+)刺激单核细胞分泌肿瘤坏死因子-(TNF-)的影响,探讨 TFE抑制 TNF- 分泌的机制以及防治关节假体的无菌性松动的可能性。方法 采集 36例健康志愿者的外周血,分离单核细胞,分组培养。实验分成 6组。A 组:仅单核细胞; B组:单核细胞+金属离子;C 组:单核细胞+金属离子+帕米膦酸钠 10 mg/L; D组:单核细胞+金属离子+TFE 5 mg/L; E组:单核细胞+金属离子+TFE 10 mg/L;F组:单
2、核细胞+金属离子+TFE 20 mg/L。单核细胞培养 48 h后,ELISA 法测定细胞上清液中 TNF- 的含量。结果 B组 TNF- 的含量明显高于 A组(P0.01); C、D、E、F 组 TNF- 的含量分别明显低于 B组(P0.01); D、E 组之间及 E、F 组之间 TNF- 的含量差异均有显著性(P0.05)。结论 金属离子可刺激单核细胞使其分泌溶骨性因子 TNF- 的量增加。TFE 与帕米膦酸钠作用效果相似,可降低溶骨性细胞因子TNF- 的分泌,随着 TFE浓度的增加,其降低 TNF- 分泌量的作用加强，从而有望成为防治关节假体松动的药物之一。 【关键词】 淫羊藿总黄酮;二
3、膦酸盐;金属离子;骨溶解;假体松动Abstract:Objective By observing the effect of total flavones of Epimedium (TFE) on secreting TNF- due to stimulation of human monocytes by metal ion cobalt(Co2+), to discuss the role of TFE in decreasing the secretion of TNF-, providing a theoretical support for using the herbal med
4、icine to prevent and treat aseptic loosening of joint prosthesis.Methods Blood samples obtained from 30 healthy human donors were processed to get the monocytes to perform the present experiment in 6 groups. group A: containing monocytes only; group B: monocytes + metal ion; group C: monocytes + met
5、al ion + pamidronate 10 mg/L; group D: monocytes + metal ion + TFE 5 mg/L; group E: monocytes + metal ion + TFE 10 mg/L; and grou F: monocytes + metal ion + TFE 20 mg/L. The mixtures were cultured for 48 h to determine the concentration of TNF- by ELISA.Results The level of TNF- was much higher in g
6、roup B than in group A, C, D, E and F (P0.01). There was significant statistical difference between group D and group E (P0.05) and between group E and group F (P0.05).Conclusion Being stimulated by metal ion, monocytes can secrete TNF-. The inhibitory effect of TFE is similar to that of pamidronate
7、, and is proportional to the concentration of TFE. It seems that TFE can be a potential therapeutic agent for the prevention and treatment of aseptic loosening of joint prosthesis.Key words： total flavones of Epimedium; bisphosphonate; metal ion; osteolysis; prosthesis failure人工关节置换目前已广泛应用于临床。人工关节磨损
8、颗粒能刺激巨噬细胞/单核细胞产生大量溶骨性因子，包括肿肿瘤坏死因子(TNF-)、白细胞介素-1(IL-1)，白细胞介素-6(IL-6)等,这些溶骨性因子能刺激破骨细胞产生骨溶解,最终导致人工关节无菌性松动1-3 。文献报道淫羊藿总黄酮(total flavones of Epimedium， TFE)可以抑制 TNF- 的基因表达,从而达到抗骨质疏松的作用4 。本实验通过体外实验将单核细胞、金属离子、二膦酸盐类药物帕米膦酸钠、TFE 共同培养,观察 TFE对金属离子诱导的溶骨性因子 TNF- 释放的影响。1 资料和方法1.1 样本采集 36例健康献血者。男 18例,女 18例,年龄3968 岁
9、,平均 52.8岁。每例采集外周血 10 ml肝素抗凝。1.2 试剂和器材 TFE(沈阳药科大学),帕米膦酸钠(南京正大天晴制药有限公司), CoCl2粉末(南康化学仪器公司),RPMI-1640 培养基(丹麦 GIBCO公司),6 孔细胞培养板(Corning 公司),胎牛血清(杭州四季青公司), TNF- 放射免疫试剂盒(北京东亚免疫技术研究所),二氧化碳培养箱(美国 Forma Scientific公司)。1.3 方法及分组 无菌采集外周血以 Hank液稀释 1倍,分层液梯度离心法分离出单核细胞。洗涤 3次,加含 10%胎牛血清的 RPMI 1640培养液制成细胞悬液,细胞计数,调整细胞
10、数至 4108/L,锥虫蓝排除法检测细胞活力均大于 95%。6 孔培养板中滴加细胞悬液,每孔加 3 ml，置 37、5% CO2恒温恒湿培养箱培养 4 h,使细胞贴壁,洗去非贴壁细胞,留下单核细胞。每板第 1孔内加入含 10%的胎牛血清的 RPMI 1640培养液 3 ml，其余 5孔加入终末浓度为 10 mg/L CoCl2溶液 3 ml，并于第 3孔加入帕米膦酸钠使其浓度为 10 mg/L,于第 4、5、6 孔加入 TFE使其浓度分别为5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L。即第 1孔为仅有单核细胞的对照组(A 组),第 2孔为单核细胞+金属离子组(B 组),第 3孔为单核细胞+金属
11、离子+帕米膦酸钠 10 mg/L(C组),第 4孔为单核细胞+金属离子+TFE 5 mg/L(D组)，第 5孔为单核细胞+金属离子+TFE 10 mg/L(E组)，第 6孔为单核细胞+金属离子+TFE 20 mg/L(F组)。各组同条件培养 48 h,取上清液,测定上清液中的 TNF- 含量。1.4 统计学处理 数据以s 表示,采用 SSPS 13. 0软件包行方差分析和 q检验。P0.05 为差异有显著性。2 结 果6种不同处理组上清液中 TNF- 含量的比较见表 1。方差分析显示,6 组细胞上清液中 TNF- 含量差异有显著性(F=3495, P0.01)。两两比较显示,B 组 TNF-
12、含量明显高于 A组(P0.01),表明金属离子可以刺激单核细胞使 TNF- 的分泌量增加;C、D、E、F 组 TNF- 含量分别明显低于 B组(P0.01), D、E 组 TNF- 含量分别与 C组之间的差异无显著性(P0.05),表明帕米膦酸钠和 TFE均能降低 TNF- 的分泌量; D、E、F 组两两之间 TNF- 含量差异均有显著性(P0.05),表明随着 TFE浓度的增加,对 TNF- 分泌量的抑制作用增强。表 1 各组细胞上清液中 TNF- 含量的比较3 讨 论迄今为止,不管假体设计得多么完美,所有类型人工关节的承重面都产生磨损颗粒5 。磨损微粒激活巨噬细胞分泌大量溶骨性因子,溶骨性
13、因子刺激破骨细胞产生骨溶解,最终导致人工关节的无菌性松动,TNF-、IL-1 和 IL-6是参与其中的主要溶骨性因子。Nakashima 等6在体外研究中发现,暴露于钛合金微粒下 48 h的巨噬细胞,其 TNF-、IL-6 的释放量分别增加了 40倍和 7倍。干预这些溶骨性因子以寻求防治关节松动的药物成为当前研究的热点。本实验通过人外周血与金属离子混合培养亦发现金属离子能够刺激单核细胞分泌大量的 TNF-,证明金属离子在关节松动中有重要的作用。二膦酸盐类药物因其在防治骨质疏松和肿瘤性骨溶解方面的成功应用,而被用来治疗关节无菌性松动。近年来的研究表明,西药二膦酸盐类能够有效抑制磨损微粒介导的骨质
14、吸收7 。TFE 是我国传统的补肾壮骨中药淫羊藿的主要成分之一。淫羊藿不但可诱导破骨细胞凋亡,抑制骨吸收,减少骨量丢失,同时可促进体外成骨细胞增殖及分化成熟8 。近年来,国外学者先后从豆科植物中提取到了具有抗骨质疏松作用的黄酮类化合物或衍生物9-10 。人工关节无菌性松动的溶骨机制与骨质疏松的骨量丢失有很大的相似性,TFE 在治疗骨质疏松方面的作用已得到充分的肯定,而且其来源广泛,价格低廉,副作用少。本实验通过检测外周血TNF- 含量发现,当单加入金属离子时细胞上清液中 TNF- 的含量较其他组为最高,这表明金属离子可以刺激 TNF- 的分泌。而加入帕米膦酸钠或 TFE后细胞上清液中 TNF-
15、 的含量明显下降,表明 TFE与帕米膦酸钠作用效果相似,可以抑制细胞因子 TNF- 的分泌,且随着 TFE浓度的增加其抑制作用加强。说明 TFE能够抑制这种刺激作用,抑制溶骨因子分泌,从而对人工关节远期松动具有一定的预防作用。【参考文献】1 Goodman SB. The effects of micromotion and particulate materials on tissue differentiation. Bone chamber studies in rabbits J. Acta Orthop Scand Suppl, 1994, 258: 1-43.2 范卫民,王青,陶松
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