1、注射用双黄连对细菌生物膜影响研究【摘 要】目的：建立大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细菌生物膜（BBF）的模型，考察注射用双黄连对 BBF 形成的影响及抑制作用。方法：在特定的条件、方法下分别对细菌单独培养和细菌与提取物共同培养，通过酶标仪测量其 OD 值来考察 BBF 的生长能力。结果：注射用双黄连对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌 BDF 的形成均有抑制作用。【关键词】双黄连；细菌生物膜；影响建立大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细菌生物膜（BBF）的模型，考察注射用双黄连对 BBF 形成的影响及抑制作用。1 BBF 模型的建立1.1 大肠杆菌 BBF 模型的建立 1.1.1 菌种的复活将大肠杆菌冻干粉加入 0.4
2、mlNB 培养基溶解后，放入 37恒温振荡器（230240 转/分钟）中培养 8 小时，分装在离心管中，加入 0.5ml 的 50%甘油，置于液氮中，于-80冰箱中冷藏保存。1.1.2 大肠杆菌 BBF 模型建立的方法将置于-80冰箱中的大肠杆菌划线于 NB 培养基的平板上，置于恒温培养箱中，于 36培养 24 小时。挑取平板上的单一菌落溶于 5mlNB 液体培养基中，于 36恒温振荡器中振荡 8 小时，得到单克隆细菌增殖培养的菌液，备用。将菌液稀释 100 倍置于 96 孔板中，四周为 NB 培养基作为空白。置于恒温培养箱中，于 36培养 24 小时，取出。将菌液倾出，用蒸馏水反复清洗后，加
3、入 0.1%结晶紫染色 30 分钟后，将结晶紫倾出，洗净，加入 1%脱氧胆酸钠溶液，30 分钟后，测其 600nm 处的 OD 值。以菌液浓度为横坐标，以 OD 值为纵坐标，考察 BBF 生长情况。1.2 影响大肠杆菌 BBF 生长的因素通过实验的反复摸索，我们发现影响大肠杆菌 BBF 生长的因素主要有以下几种：菌种：不同的大肠杆菌菌株对 BBF 的影响很大，直接影响到 BBF 的生长与否和 BBF 形成的好坏。且大肠杆菌传代越多，BBF 的生长情况越不好，故我们每次实验均采用大肠杆菌的第二代菌株。96 孔板的材质：不同的细菌在不同材质的 96 孔板上的生长情况是不同的。我们选用了市场上常见的
4、三种 96 孔板分别是进口聚氯乙烯（PVC）板，国产聚苯乙烯（PS）板，进口聚苯乙烯板，大肠杆菌分别在不同材质的 96 孔板上培养。结果，大肠杆菌在国产 PS 板上的生长情况是最好的。培养时间：考虑到实验操作时间的可行性，我们选定将大肠杆菌分别培养 18 小时、24 小时、36 小时，考察 BBF 的生长情况。结果，大肠杆菌在培养 24 小时后，BBF 的生长情况最好。1.3 金黄色葡萄球菌 BBF 的建立及影响因素金黄色葡萄球菌的BBF 模型的建立方法基本上与大肠杆菌的相同。在这里就不做详细的介绍。我们仍旧分别考察了 96 孔板的材质、培养时间及菌液浓度等因素，最终确定金黄色葡萄球菌菌液稀释
5、 100 倍、于国产 PS 板上培养 24 小时，BBF的生长的最好且稳定。2 注射用双黄连对 BBF 的影响2.1 培养方法的建立我们建立两种方法分别考察药物对 BBF 形成的影响及对 BBF 的抑制作用。96 孔板的点样方法 1：四周为菌液（NB 培养基） 。B 行加入 180l 菌液（NB 培养基） ，CG 行每孔各加入 100l 菌液（NB培养基） ，B 行每孔用移液枪加入 20l 药液，混匀，用多通道移液枪从B 行吸出 100l 移入 C 行，混匀，再从 C 行吸出 100l 移入 D 行，依此类推至 H 行，吸出 100l 后，弃去。即从 BH 行药液浓度以 2 倍递减。96 孔板
6、的点样方法 2：四周为菌液。BG 行加入 100lNB 培养基，B 行每孔用移液枪加入 100l 药液，混匀，用多通道移液枪从 B 行吸出100l 移入 C 行，混匀，再从 C 行吸出 100l 移入 D 行，依此类推至 H行，吸出 100l 后，弃去。即从 BH 行药液浓度以 2 倍递减。培养方法一：考察对 BBF 形成的影响。按“96 孔板点样方法 1”完成后，依照“大肠杆菌 BBF 模型建立的方法”中置于恒温培养箱中，于 36培养 24 小时，以药液浓度为横座标，以平均 OD 值为纵坐标，作图，考察对 BBF 形成的影响。培养方法二：考察对 BBF 的抑制作用我们先将 96 孔板全部点菌
7、液，依照“大肠杆菌 BBF 模型建立的方法”置于恒温培养箱中，于 36培养24 小时，取出，此时 BBF 已经形成，将菌液倾出，按“96 孔板点样方法”，将培养基培养 24 小时，以药液浓度为横座标，以平均 OD 值为纵坐标，考察对 BBF 的抑制作用。2.2 考察对 BBF 形成的影响图 1 注射用双黄连对大肠杆菌 BBF 形成的影响将注射用双黄连加水溶解，配制成 5mg/ml 的药液，分别进行对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌培养的操作。注射用双黄连对大肠杆菌 BBF 形成的影响结果见图 1 所示。3 讨论1）通过实验摸索，建立了可靠而稳定的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌细菌生物膜（BBF）的模型，确定
8、了影响因素。2）96 孔板清洗方法的摸索：96 孔板的材质是 BBF 模型能够成功建立的重要因素，确定 96 孔板的清洗方法：先在 96 孔板内加注洗液，浸泡 35 分钟后，用手握持 96 孔板，甩干孔内液体；再用乙醇浸泡 24小时后超声 20 分钟，自然晾干，即可。3）考察了注射用双黄连对 BBF 形成的影响。得出注射用双黄连对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌 BBF 的形成均有明显的抑制作用。4 结语本实验建立了可靠而稳定的 BBF 模型，并通过此模型考察了中药注射用双黄连对 BBF 形成的影响，筛选出能够抑制或破坏 BBF 形成的活性成分，为从中药中开发治疗慢性感染性疾病的新药提供新的筛选模型，
9、为科学、客观评价中医药在治疗慢性感染方面的作用提供了新的方法。参考文献1Baver T，et al.Biofilm formation in endotracheal tubes：As-sociation between pneumonia and the persistence of pathogents.Monaldi Arch Chest Dis，2002， （57）：84.2Dagupta M K.Biofilms and infection in dialysis patients.SeminDial，2002， （15）：338.3Costerton J W，et al.Bacterial biofilms.Sci Am，2001.
