1、自然更年期大鼠 IL-2、TNF、TGF 和 IL-2R mRNA 变化及“逆针”关元穴对其影响的研究作者：何玉伟 李晓泓 张露芬 解秸萍 翟景慧 周军 周登芳 郑玲 曲黎敏 田阳春【摘要】 ：目的 探讨逆针关元穴对自然更年期大鼠血清、子宫的细胞因子白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子(TNF)、转化生长因子(TGF)和脾脏白细胞介素-2 受体 mRNA(IL-2R mRNA)的影响及其机制。方法 将112 只已经通过阴道涂片筛查的 10 月龄 SD 雌性大鼠随机分为 7 组,另3.5 月龄 1 组 16 只。采用放射免疫、原位杂交等方法,观察 10 月龄逆针关元穴(2 次/周,连续 8
2、周)对随后 12、14、16 月龄大鼠血清、子宫的细胞因子 IL-2、TNF、TGF 和脾脏 IL-2R mRNA 的影响。结果 与自然年轻组相比,模型对照各组血清和子宫 IL-2、TGF 及子宫 TNF 均下降,血清 TNF水平呈先降后升的波动性变化,脾脏 IL-2R mRNA 表达水平下降；而预先介入逆针疗法后,与自然同月龄组相比,逆针各组血清和子宫 IL-2、TGF及子宫 TNF 上升,其中逆针 14、16 月龄组血清 TGF,逆针 12、16 月龄组子宫 IL-2,逆针 12 月龄组子宫 TNF 和逆针 12、16 月龄组子宫 TGF 均明显提高(P0.05,P0.01,P0.01,P
3、0.05,P0.01, P0.05,P0.05)。血清 TNF 水平与模型对照组呈相反的波动性变化,其中逆针 12、14 月龄组差异显著(均 P0.05)。脾脏 IL-2R mRNA上调,其中逆针 14 月龄差异显著(P0.05)。结论 逆针关元穴可以调节随后更年期大鼠血清和子宫的细胞因子 IL-2、TNF、TGF 水平和脾脏IL-2R mRNA 的表达,这可能是该疗法改善更年期免疫功能的机制之一。 【关键词】 逆针 关元穴 自然更年期大鼠 白细胞介素-2 肿瘤坏死因子 转化生长因子 白细胞介素-2 受体 mRNAAbstract：Objective To observe the effect
4、 on IL-2, TNF, TGF in uterus and serum, and IL-2RmRNA in spleen of menopausal rats with preventive accupuncture on Guanyuan point, and analysis the mechanism. Methods 112 ten month-aged SD female rats examined by vaginal smear were chosen and divided into seven groups. And another 16 three point fiv
5、e month-aged SD female rats were another group. Radio-immunity and hybridiztion in situ methods were applied to observe the effect on IL-2, TNF, TGF in uterus and serum and IL-2R mRNA in spleen of 12, 14 and 16 month-aged menopausal rats with preventive accupuncture on Guanyuan point (twice a week,
6、eight weeks continued) in 10th month. Results Compared with the normal group, IL-2, TGF in uterus and serum and TNF in uterus of menopausal rats reduced, TNF in serum came down in the 12th month and went up in 14th and 16th month, IL-2R mRNA in spleen decreased. Compared with the same-aged model gro
7、up, IL-2, TGF of serum and uterus and TNF in uterus increased. TGF in serum of 14 and 16 month-aged group, IL-2 in uterus of 12 and 16 month-aged group, TNF in uterus of 12 month-aged group and TGF in uterus of 12 and 16 month-aged group rised significantly (P0.05 or P0.01). TNF in serum presented a
8、 converse wave-like change and it increased apparently of the 12 and 14 month-aged group (P0.05). IL-2R mRNA increased with preventive acupuncture and it went up distinctly in the 14th month (P0.05). Conclusion Preventive accupuncture on Guanyuan point can improve the immunologic function of menopau
9、sal rats, which is probably related to the dominating of IL-2, TNF and TGF in serum and uterus, and IL-2R mRNA in spleen.Key words：preventive accupuncture；natrual menopausal rats；immunity；IL-2；TNF；TGF；IL-2R mRNA逆针是指在机体无病或疾病发生之前预先应用针刺方法提高机体应激与耐受能力,从而防止疾病的发生、减轻随后疾病的损害和保健延年的一种方法。更年期是妇女走向衰老的重要转折点,此期机体的神
10、经、内分泌整体性失调,免疫功能亦趋向于紊乱。本实验结合以往的研究1-2,采用在更年期之前逆针关元穴的方法,观察其对随后自然更年期大鼠血清、子宫的细胞因子白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子(TNF)、转化生长因子(TGF)和脾脏白细胞介素-2 受体 mRNA(IL-2R mRNA)的影响,以进一步探讨该疗法对更年期免疫功能的调节机制。1 材料与方法1.1 动物及模型制备根据实验动物生命阶段划分法,选中年后期 9.5 月龄 SD 雌性大鼠,通过阴道涂片法3,即每日定时将大鼠的阴道涂片用碱性美蓝溶液染色后在显微镜下观察其组织学变化,连续观察 3 个动情周期(15 d,从 9.5 月龄至 10
11、月龄)。根据细胞形态、种类及数量筛选已开始出现动情周期紊乱(预示即将或开始进入更年期)的大鼠 112 只,体重(30020)g,纳入本实验,将其随后的 1216 月龄作为自然老化鼠更年期模型。另选健康 SD 雌性大鼠 3.5 月龄 16 只,体重(24020)g。所用 SD 雌性大鼠均为清洁级,购自北京维通利华实验动物技术有限公司SCXK (京)2002-0003。1.2 分组将经过阴道涂片筛选出开始出现动情周期紊乱 10 月龄 SD 雌性大鼠 112 只,按照随机数字法4分为 7 组,每组 16 只,其中 3 个逆针组(12、14、16 月龄逆针组),3 个模型对照组(12、14、16 月龄
12、对照组),1个 10 月龄对照组。另选健康 SD 雌性大鼠 3.5 月龄 16 只,体重(24020)g,为自然年轻组。共 8 组,同等条件下饲养。1.3 仪器及试剂仪器：GC-911-放射免疫计数器；ER-182A 型电子天平(日本)；电热恒温水浴箱；ZK380 型低温离心机(德国)；DY89-1 型电子玻璃匀浆机；美国 MIS-2000 SP 型 3Y 显微图像分析仪；3Y 分析软件(Pro,Ver.4.0)；日产 Nikon H8-202 AN；Polariod 数码显微摄像机。试剂：IL-2、TNF、TGF 放免试剂盒购自北京华英生物技术研究所；IL-2R mRNA 原位杂交探针、试剂
13、盒均购自中山试剂公司。1.4 逆针组及模型对照组的处理方法所有逆针组大鼠均在 10 月龄开始针刺,方法为轻抓大鼠让其仰躺在手掌上,待其安静后,取关元穴(鼠后肢根部在下腹连线的中点)下约 2 分处将针直刺 2 分,后斜向上刺入,留针 20 min。留针过程中让大鼠处于自由状态。每周针 2 次,共针 8 周。自然年轻组、模型对照组及 10 月龄对照组除象逆针组轻抓仰躺外不作任何处理。1.5 取材及样品基础处理每组大鼠取 10 只进行指标检测。各组大鼠断头取血,室温血液自然凝固 15 min 后,2 500 r/min 离心 20 min,取上清,-70 保存待测。冰上迅速摘取左侧子宫,在生理盐水中
14、煮沸 5 min 称重,置于玻璃匀浆管中,加入 1 mol/L HCL 1 mL,于冰上在匀浆机上进行匀浆,充分匀浆后室温放置 100 min,加入 1 mol/L NaOH 0.8 mL 中和至一定的 pH 值,3 500 r/min 离心 15 min,取上清,-70 保存待测。每组余 6 只应用蓝格蠕动泵经左心室到主动脉进行灌注,先用生理盐水冲洗,再用 4%多聚甲醛磷酸缓冲液初步固定,然后取出大鼠脾脏组织,放在 4%多聚甲醛磷酸缓冲液中继续固定,一定时间后进行包埋、切片(56 m)。1.6 指标检测血清、子宫 IL-2、TNF、TGF 水平检测：采用放射免疫法,测定方法严格按试剂盒说明书
15、操作程序操作；脾脏 IL-2R mRNA 水平检测：取脾脏的石蜡切片进行分子原位杂交,脱水,封片,采用美国 Image-Pro. Plus Version4.5.1 图像分析软件,计算吸光度(IOD)值。1.7 统计学方法所有数据以 xs 表示。各组组间差异采用方差分析,以P0.05、P0.01 作为显著性差异和极显著性差异的标准。2 结果(见表 1表 3) 表 1 逆针前后自然更年期大鼠血清 IL-2、TNF、TGF 的变化(略)注：与自然年轻组比较,*P0.05,*P0.01；与自然同月龄组比较,P0.05,P0.01(下同)表 2 逆针前后自然更年期大鼠子宫 IL-2、TNF、TGF 的
16、变化(略)表 3 逆针前后自然更年期大鼠脾脏 IL-2R mRNA 表达水平(IOD)的变化(略)3 讨论更年期是妇女走向衰老的关键启动期,此期机体的神经内分泌失调的同时,免疫因子及免疫功能也出现紊乱5-6。本研究选取自然老化大鼠更年期模型,并以阴道涂片筛查法确保了模型的统一性。结果发现：大鼠进入更年期后,血清和子宫 IL-2、TGF,子宫 TNF 及脾脏 IL-2R mRNA 表达水平均下降,血清 TNF 水平呈先降后升的波动性变化,与文献报道基本一致7-9。提示更年期大鼠机体已处于免疫失调状态。而于 10 月龄介入逆针关元穴(2 次/周,连续 8 周)的方法,可使同期大鼠血清、子宫的细胞因
17、子出现良性调节的趋势：血清和子宫 IL-2、TGF 和子宫 TNF 的水平大体上呈上调趋势,血清 TNF 水平呈与同龄对照组相反的波动性变化。说明逆针关元穴,可对随后的更年期血清、子宫的细胞因子产生影响,使之维持在适当的水平,进而通过促进免疫细胞的增值分化、提高免疫细胞的活性、诱导肿瘤细胞的凋亡等途径发挥更年期免疫功能的保护作用。逆针对 IL-2、TGF、TNF 的调节作用主要体现在逆针 12、16 月龄,14 月龄变化多不明显,说明逆针有一定的即时效应和累积效应(逆针从 10 月龄开始,持续 8 周,即逆针结束时约相当于大鼠的 12 月龄)。与自然同月龄对照组相比,逆针后脾脏 IL-2R m
18、RNA 表达水平均升高,提示逆针可以通过提高具有免疫调节功能的细胞因子受体基因表达来改善机体的免疫失调。但与对细胞因子的影响不同的是,逆针后脾脏 IL-2R mRNA 表达水平 14 月龄差异显著,这也从一定程度上说明了基因优先于蛋白表达,14 月龄 IL-2R mRNA 表达水平的显著提高可能是 16 月龄累积效应的潜在力量。但逆针关元穴究竟通过什么内在的级联信息影响这些细胞因子的确切机制有待进一步研究证明。【参考文献】1 李晓泓,解秸萍.逆灸关元穴对不同月龄更年期大鼠肿瘤坏死因子- 及脾脏雌激素受体- 的影响J.中国临床康复,2006,10(43)：171173.2 李晓泓,解秸萍,张露芬
19、,等.逆灸对自然更年期大鼠子宫组织形态及 E2、P 和 ER- 影响的实验研究J.北京中医药大学学报,2006,29(8)：558561.3 施新遒.现代医学实验动物学M.北京：人民军医出版社,2000.330332.4 孙振球.医学统计学M.北京：人民卫生出版社,2002.540.5 Paganelli R, Di Iorio A, Cherubini A, et al. Frailty of older age：the role of the endocrine-immune interactionJ.Curr Pharm Des,2006,12(24)：31473159.6 Ryan-B
20、orchers TA, Park JS, Chew BP, et al. Soy isoflavones modulate immune function in healthy postmenopausal womenJ.Am J Clin Nutr,2006,83(5)：11181125.7 林燕萍,周瑞祥,王和鸣,等.健骨颗粒对去卵巢骨质疏松模型鼠血清肿瘤坏死因子 及转化生长因子 的影响J.中国临床康复,2005,9(34)：187189.8 杨明华,杨苏蓓,龙 森,等.坤怡宁对雌性去卵巢大鼠生殖内分泌-免疫的影响J.中国中药杂志,2006,31(13)：11071109.9 王 敏,王
21、平 ,洪小平,等.从 IL-2 及其受体表达探讨党参在延缓衰老中的作用J.中华中医药杂志,2006,21(10)：629630.【摘要】 ：目的 探讨逆针关元穴对自然更年期大鼠血清、子宫的细胞因子白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子(TNF)、转化生长因子(TGF)和脾脏白细胞介素-2 受体 mRNA(IL-2R mRNA)的影响及其机制。方法 将112 只已经通过阴道涂片筛查的 10 月龄 SD 雌性大鼠随机分为 7 组,另3.5 月龄 1 组 16 只。采用放射免疫、原位杂交等方法,观察 10 月龄逆针关元穴(2 次/周,连续 8 周)对随后 12、14、16 月龄大鼠血清、子宫的细胞
22、因子 IL-2、TNF、TGF 和脾脏 IL-2R mRNA 的影响。结果 与自然年轻组相比,模型对照各组血清和子宫 IL-2、TGF 及子宫 TNF 均下降,血清 TNF水平呈先降后升的波动性变化,脾脏 IL-2R mRNA 表达水平下降；而预先介入逆针疗法后,与自然同月龄组相比,逆针各组血清和子宫 IL-2、TGF及子宫 TNF 上升,其中逆针 14、16 月龄组血清 TGF,逆针 12、16 月龄组子宫 IL-2,逆针 12 月龄组子宫 TNF 和逆针 12、16 月龄组子宫 TGF 均明显提高(P0.05,P0.01,P0.01,P0.05,P0.01, P0.05,P0.05)。血清
23、 TNF 水平与模型对照组呈相反的波动性变化,其中逆针 12、14 月龄组差异显著(均 P0.05)。脾脏 IL-2R mRNA上调,其中逆针 14 月龄差异显著(P0.05)。结论 逆针关元穴可以调节随后更年期大鼠血清和子宫的细胞因子 IL-2、TNF、TGF 水平和脾脏IL-2R mRNA 的表达,这可能是该疗法改善更年期免疫功能的机制之一。 【关键词】 逆针 关元穴 自然更年期大鼠 白细胞介素-2 肿瘤坏死因子 转化生长因子 白细胞介素-2 受体 mRNAChanges of IL-2, TNF, TGF and IL-2R mRNA of Menopausal Rats and Eff
24、ects of Preventive Acupuncture on Guanyuan Point HE Yu-wei, LI Xiao-hong, ZHANG Lu-fen, et alBeijing University of TCM, Beijing 100029, ChinaAbstract：Objective To observe the effect on IL-2, TNF, TGF in uterus and serum, and IL-2RmRNA in spleen of menopausal rats with preventive accupuncture on Guan
25、yuan point, and analysis the mechanism. Methods 112 ten month-aged SD female rats examined by vaginal smear were chosen and divided into seven groups. And another 16 three point five month-aged SD female rats were another group. Radio-immunity and hybridiztion in situ methods were applied to observe
26、 the effect on IL-2, TNF, TGF in uterus and serum and IL-2R mRNA in spleen of 12, 14 and 16 month-aged menopausal rats with preventive accupuncture on Guanyuan point (twice a week, eight weeks continued) in 10th month. Results Compared with the normal group, IL-2, TGF in uterus and serum and TNF in
27、uterus of menopausal rats reduced, TNF in serum came down in the 12th month and went up in 14th and 16th month, IL-2R mRNA in spleen decreased. Compared with the same-aged model group, IL-2, TGF of serum and uterus and TNF in uterus increased. TGF in serum of 14 and 16 month-aged group, IL-2 in uter
28、us of 12 and 16 month-aged group, TNF in uterus of 12 month-aged group and TGF in uterus of 12 and 16 month-aged group rised significantly (P0.05 or P0.01). TNF in serum presented a converse wave-like change and it increased apparently of the 12 and 14 month-aged group (P0.05). IL-2R mRNA increased with preventive acupuncture and it went up distinctly in the 14th month (P0.05). Conclusion Preventive accupuncture on Guanyuan point can improve the immunologic function of menopausal rats, which is probably related to the dominating of IL-2, TNF and TGF in
