1、固相萃取 同位素稀释 气相色谱 串联质谱法测定化妆品中的二甲苯麝香作者：马强 白桦 王超 马微 张庆 肖海清 周新 董益阳 王宝麟【摘要】 建立了测定化妆品中二甲苯麝香的固相萃取 同位素稀释 气相色谱 串联质谱分析方法。膏霜、水剂、散粉、香波、唇膏等不同类型的化妆品样品加入甲醇经超声提取后，样品提取液高速离心处理，浓缩上清液，以 SepPak Silica 固相萃取柱净化，收集二氯甲烷洗脱液，DB5 MS（30 m 0.25 mm, 0.25 m ）石英毛细管色谱柱分离后经 NCIGCMS/MS 多反应监测技术进行定性及定量分析。二甲苯麝香的方法定量限为 5 g/kg，在 550 g/kg 范
2、围内的 3 个添加水平的平均回收率为 81.1%86.9%，日内精密度均小于 10%，日间精密度均小于12%。本方法准确、快速、灵敏度高，可用于化妆品的实际检验工作。 【关键词】 固相萃取，同位素稀释，气相色谱 串联质谱，化妆品，二甲苯麝香1 引言二甲苯麝香（Musk xylene）化学名 2,4,6 三硝基1,3 二甲基5 叔丁基苯，是人工合成的硝基芳族麝香化合物，常用作化妆品和皂用香精的定香剂1。二甲苯麝香作为高持久性、高生物蓄积性物质2,3，已被欧盟化学品管理署列为高关注物质4。我国化妆品卫生规范5及欧盟化妆品规程（Council Directive 76/768/EEC）6中规定二甲苯
3、麝香为化妆品组分中限用物质（不得用于口腔卫生用品） ，在香精、花露水和其它产品中的限量分别为 1.0%、0.4%和 0.03%。国际日化香料协会计划在 IFRA 标准第 44 次修订稿中建议二甲苯麝香不作为日化香料成分使用7。国际日化香料研究所也建议二甲苯麝香不得用于唇用产品或口腔卫生用品8。关于二甲苯麝香检测的研究报道主要集中在化妆品9,10、生物样品11、环境样品12等方面，涉及的方法主要包括薄层色谱法（TLC）9、毛细管电泳法（CE）13、气相色谱 电子捕获检测法（GCECD ）14、气相色谱 质谱法（GCMS ）12、气相色谱 高分辨质谱法（GCHRMS ）15、气相色谱 串联质谱法（
4、GCMS MS）11、核磁共振法（NMR）16等。目前，化妆品中二甲苯麝香的分析测定方法多为薄层色谱法、气相色谱法、气相色谱 单四极杆质谱法等，尚未见同位素稀释 气相色谱 串联质谱法测定化妆品中二甲苯麝香的研究报道。本研究采用固相萃取、同位素稀释、气相色谱 质谱联用等技术，利用二甲苯麝香分子结构中的电负性基团在负化学电离源中具有较高灵敏度，结合串联四极杆质谱高选择性的优势，实现了对二甲苯麝香的精准测定。本方法准确、快速、灵敏度高，适用于化妆品的实际检验工作和产品质量控制。2 实验部分2.1 仪器与试剂7890A 气相色谱仪（美国 Agilent 公司） 、Quattro micro GC 三重
5、四极杆质谱仪，配有化学电离源和电子轰击源（美国 Waters 公司） ；KQ600B 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司） ；MS2 型漩涡振荡器（德国 IKA 公司） ；CR 21G 型高速冷冻离心机（日本 Hitachi 公司） ；TurboVap 氮吹仪（美国 Caliper 公司） ；GX274 ASPEC 型全自动固相萃取仪（美国 Gilson 公司） ；N1000 型旋转蒸发仪（日本 Eyela 公司） ，配有 BC55 型真空冷却系统（日本 Yamato 公司） ；SepPak Silica 固相萃取柱（500 mg，6 mL，美国 Waters 公司） ；Acrodisc
6、GHP 双性滤膜（美国 Pall 公司） ；甲醇、正己烷、二氯甲烷和四氢呋喃（HPLC 级，美国 Fisher 公司） ；氦气、氩气和甲烷气（99.999%） ；其它试剂均为分析纯（北京化工厂） 。二甲苯麝香（纯度 99.5%）及其氘代标准品 d15二甲苯麝香（纯度 97.5%）均购自德国 Dr. Ehrenstorfer 公司。2.2 色谱质谱条件DB5 MS 5%苯基甲基聚硅氧烷石英毛细管色谱柱（30 m 0.25 mm， 0.25 m） ；进样口温度 250 ；柱温：初始温度 50 ，保持 1 min，以 20 /min 程序升温至 300 ，保持 3 min；不分流进样；进样量 1 L
7、；载气为高纯氦气，流速 1.0 mL/min；传输线温度 250 ；负化学电离源（NCI） ；源温度 100 ；电子能量 60 eV；接收极电流 200 A；反应气为甲烷（75%） ；光电倍增器电压 650 V；碰撞气体为氩气，碰撞气压 3.2 Pa；溶剂延迟时间 3 min；多反应监测（MRM）模式检测，二甲苯麝香及其同位素内标的质谱分析参数见表 1。表 1 二甲苯麝香及其同位素内标的质谱分析参数（略）Table 1 MS parameters for musk xylene and d15musk xylene analysis2.3 标准储备液与工作液的配制准确称取二甲苯麝香标准品 10
8、0 mg，用正己烷溶解并定容至 100 mL，配制成 1000 mg/L 二甲苯麝香标准储备液，于20 下保存。准确量取 d15 二甲苯麝香标准溶液 1 mL，转移至 10 mL 容量瓶中，用正己烷定容至刻度，配制成 10 mg/L 氘代二甲苯麝香标准储备液。使用时，用正己烷逐级稀释成二甲苯麝香浓度分别为 2.5， 5， 10， 50， 100和 200 g/L 混合标准工作溶液，其中 d15 二甲苯麝香浓度均为 100 g/L，于 4 下保存，现用现配。2.4 样品处理2.4.1 膏霜、水剂、散粉、香波类样品的处理 准确称取化妆品试样 0.500 g 于 25 mL 具塞比色管中，准确加入
9、1 mg/L d15 二甲苯麝香内标溶液 0.1 mL，再加 10 mL 甲醇，涡旋混匀，超声提取 20 min 后，以 12000 r/min 转速离心 15 min，收集上清液于 50 mL 鸡心瓶中，用旋转蒸发仪于 40 水浴浓缩至近干，用氮气缓慢吹干后，准确加入 2 mL二氯甲烷溶解残渣，溶液用于固相萃取。SepPak Silica 固相萃取柱用5 mL 甲醇活化、5 mL 二氯甲烷平衡后，将试样溶液过柱，弃去直接流出液，再用 2 mL 二氯甲烷洗脱。收集洗脱液，用氮气缓慢吹干后，准确加入 1 mL 正己烷溶解残渣，过 0.20 m 微孔滤膜后，供 GCMS/MS 测定。2.4.2 唇
10、膏类样品的处理 准确称取化妆品试样 0.500 g 于 25 mL 具塞比色管中，准确加入 1 mg/L d15 二甲苯麝香内标溶液 0.1 mL，加入 2 mL 四氢呋喃，超声提取 5 min，再加 8 mL 甲醇，涡旋混匀，超声提取 20 min 后，以 12000 r/min 转速离心 15 min，收集上清液于 50 mL鸡心瓶中，用旋转蒸发仪于 40 水浴浓缩至近干，用氮气缓慢吹干后，准确加入 2 mL 二氯甲烷溶解残渣，溶液用于固相萃取。SepPak Silica 固相萃取柱用 5 mL 甲醇活化、5 mL 二氯甲烷平衡后，将试样溶液过柱，弃去直接流出液，再用 2 mL 二氯甲烷洗
11、脱。收集洗脱液，用氮气缓慢吹干后，准确加入 1 mL 正己烷溶解残渣，过 0.20 m 微孔滤膜后，供 GCMS/MS 测定。3 结果与讨论3.1 色谱分离条件的优化分别考察了不同固定液、不同极性的气相色谱柱：非极性柱（DB1MS ，100%二甲基聚硅氧烷固定液；DB5MS ，5%苯基95% 甲基聚硅氧烷固定液） 、中等极性柱（DB1701 ，14%氰丙基 苯基86% 甲基聚硅氧烷固定液） 、强极性柱（HPINNOWax ，聚乙二醇固定液）对二甲苯麝香的色谱分离效果。二甲苯麝香的正辛醇/水分配系数（Kow）为 4.9，属弱极性化合物，同时化妆品配方中通常含有较多的非极性成分，如油脂、蜡、脂肪酸
12、、醇、酯等17，根据“相似相溶”原理，选用 DB5MS非极性毛细管气相色谱柱对于二甲苯麝香与基质中干扰物质的色谱分离具有较好的选择性，可有效消除或降低样品基质对待分析物电离的抑制。对于组成复杂的化妆品样品分析，需要较高的柱效，故采用柱容量较低的 0.25 mm 微口径和 0.25 m 较薄的液膜，以降低色谱柱流失，提高柱效。3.2 离子化方式的选择和质谱条件的优化已有文献报道采用化学电离源（CI）18和电子轰击源（EI）11 检测二甲苯麝香。本研究分别考察了二甲苯麝香在 CI 和 EI 下的电离效果，结果表明，由于二甲苯麝香分子结构中带有电负性原子（N 和 O） ，其在负化学电离源（NCI）较
13、 EI 和正化学电离源（PCI）具有更高的灵敏度。CI 作为一种软电离模式，背景信号低，结合二级质谱定性高准确度的特点，CI 体现出比 EI 更低背景干扰，且不降低检测灵敏度的优势。同时利用 NCI 对电负性基团选择性强的特点，有助于消除目标化合物色谱共流出峰中可能存在的不含电负性基团物质的干扰，故本实验选择 NCI作为离子化方式。二甲苯麝香在 NCI 电离方式下的质谱裂解方式具有硝基芳香族化合物的裂解特点，易丢失 NO 而得到丰度高于分子离子峰的基峰离子 m/z 267.0（MNO） ，为获得更高的检测灵敏度，将其作为母离子。根据欧盟 2002/657/EC 指令19规定对于质谱确证方法必须
14、达到 4 个确证点的要求，低分辨气相色谱 质谱联用仪应在确定母离子的基础上选择两个以上的子离子。 图 1 二甲苯麝香(a)及同位素内标(b)的 MRM 色谱图Fig.1 MRM chromatogram of musk xylene(a) and d15musk xylene as internal standard(b)在确定二甲苯麝香的母离子后，采用子离子扫描方式进行二级质谱分析，选取丰度较强的主要碎片离子 m/z 174.9（MNO2NO2）作为定量子离子，m/z 146.9（MNO2NO2CO）作为辅助定性子离子。通过优化碰撞能量、离子能量、质谱分辨率、甲烷气流量等质谱参数，使二甲苯麝
15、香的基峰离子与特征碎片离子产生的离子对强度达到最大。二甲苯麝香及其氘代同位素内标的 MRM 色谱图见图。3. 样品提取条件的优化化妆品样品常用提取方法为振荡提取、加热提取、微波提取、超声提取等20。为了减少操作步骤及获得尽可能高的提取效率，采用超声提取方式对样品进行提取。二甲苯麝香难溶于水，在弱极性或中等极性的有机溶剂中有较好的溶解度。按照 2.4.1 节的方法处理不含二甲苯麝香的膏霜化妆品样品，进行 50 g/kg 水平的添加回收实验。分别考察了不同的提取剂（正己烷、二氯甲烷、丙酮、甲醇、无水乙醇）和提取时间（10， 15， 20， 25 及 30 min）等条件下的提取效果，结果见表2。经
16、实验筛选，确定了样品提取方法。由于唇膏类样品中含有较多的油脂、蜡等成分，加入四氢呋喃可有效溶解样品基质，有利于样品的提取。表 2 提取剂和提取时间对提取率的影响（n=3） （略）Table 2 Effect of extraction solvents and duration on recovery of musk xylene（n=3）3.4 固相萃取净化条件的优化化妆品样品基质复杂，如果样品提取液不进行净化，有可能会干扰待测化合物出峰，污染仪器，影响定性和定量分析结果。分别考察了 C18柱（Supelclean LCC18 、SepPak C18） 、亲水亲脂柱（Oasis HLB） 、
17、石墨化碳黑柱（Supelclean EnviCarb ）和硅胶柱（SepPak Silica）对二甲苯麝香的净化效果，结果见表 3。由表 3 可见，硅胶柱的净化效果和回收率最优。采用硅胶柱为固相萃取柱，先用 5 mL 甲醇活化固定相，并除去固定相中的杂质，再用 5 mL 二氯甲烷平衡。实验发现，02 mL 的上样溶液体积对样品回收率没有明显影响，当继续增加上样溶液体积时，开始有二甲苯麝香流出。考察了不同配比的甲醇 二氯甲烷混合液淋洗系统（用量均为 2 mL）的洗脱效果。根据洗脱曲线，以二氯甲烷为淋洗液时，二甲苯麝香可被完全洗脱，而样品基质中的大部分杂质仍将保留在固相萃取柱上，不会被洗脱下来，故
18、将其作为洗脱液。进一步对洗脱液的洗脱体积进行了考察。结果表明，2 mL 洗脱液可将二甲苯麝香完全洗脱，获得了最佳的回收率。表 3 不同固相萃取柱净化效果的比较（n=3） （略）Table 3 Comparison of cleanup effects of different SPE cartridges（n=3）3. 线性范围和定量限采用氘代标准品（d15 二甲苯麝香）为内标，二甲苯麝香以内标法定量，选择离子 267.0/174.9, 282.1/190.1 定量。分别配制一系列标准工作溶液，在选定的色谱条件和质谱条件下进行测定，在标准品浓度为2.5200 g/L 范围内，二甲苯麝香的线性方
19、程为：Y = 0.2047X+0.448，r=0.9993。以信噪比为 10 估算定量限（LOQ） ，二甲苯麝香的定量限为 5 g/kg。3. 方法的回收率和样品分析采用阴性的膏霜、水剂、散粉、香波、唇膏等不同类型的化妆品样品，分别进行添加回收率和精密度实验，样品添加不同浓度的标准溶液，按本方法进行实验，用气相色谱 串联四极杆质谱进样测定。在低、中、高的 3 个添加水平范围内的平均回收率（每个添加浓度平行测定 6 次）为 81.1%86.9%，其回收率结果见表 4。日内精密度均小于 10%，日间（5 d 内）精密度均小于 12%。应用本方法对清洁类、护理类、美容/修饰类等不同类型的洗面奶、清洁
20、霜、浴液、乳液、香水、粉饼、眼影、洗发液、护发素、润唇膏、唇彩等进口化妆品样品共 35 件和国产化妆品样品共 15 件进行了分析测定。结果表明，有 1 件化妆品样品筛检出含有 287 g/kg 二甲苯麝香。表 4 二甲苯麝香的加标回收率和相对标准偏差(n=6)（略）Table 4 Spiked recoveries and RSD for musk xylene(n=6)【参考文献】1 Chen ShiNeng( 陈士能). Encyclopedia of Chinese Chemical Products(中国化工产品大全. 下卷). Beijing(北京): Chemical Indust
21、ry Press(化学工业出版社), 1998： 125212532 Support Document for Identification of 5tertbutyl2,4,6trinitromxylene as a Substance of Very High Concern. European Chemicals Agency3 Regulation(EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of the Council of 18 December 2006. Concerning the Registration, Evaluat
22、ion, Authorisation and Restriction of Chemicals(REACH), stablishing a European Chemicals Agency, mending Directive 1999/45/EC and repealing Council Regulation(EEC) No 793/93 and Commission Regulation(EC) No 1488/94 as well as Council Directive 76/769/EEC and Commission Directives 91/155/EEC, 93/67/EEC, 93/105/EC and 2000/21/EC4 http:/echa.europa.eu/chem_data/candidate_list_table_en.asp5 Ministry of Health of the Peoples Republic of China(中华人民共和国卫生部). Hygienic Standard for Cosmetics(化妆品卫生规范). Beijing(北京)， 2007
