1、离心洗涤对精子形态的影响作者：梁琳，赵晓曦，王丽岩，宋静慧，陈秀娟 【摘要】 目的 探讨常规精子形态学染色中离心洗涤步骤对分析结果的影响。方法 47 例人精液标本进行常规检测密度及活力后，分别在离心前后涂片，应用快速苏木素-伊红染色法进行染色，检测精子头部、体部、尾部畸形率。对比精子畸形指数(SDI)和畸形精子指数(TZI)是否受到离心洗涤的影响。结果 离心洗涤后的精子头部畸形率和正常精子率较离心前直接涂片无显著差异，体部畸形率、尾部畸形率、SDI、TZI 各指数在离心前后的差异均有统计学意义。不经过离心洗涤精浆而直接采用 WHO推荐的制备涂片方法的精液标本染色后碎屑较多，但是不影响分析。结论
2、 精子形态学分析中离心精液对精子畸形指数(SDI)和畸形精子指数(TZI)有影响。但是不影响形态正常精子的比率。精液不经离心洗涤直接涂片适用于非严重少精及黏稠度低的标本。 【关键词】 精子;离心;洗涤;形态;染色Abstract Objective To evaluate the influence of sperm washing on accuracy of sperm morphometry.Methods Semen analyses were carried out according to the World Health Organization manual for 47 su
3、bfertile men，film preparation before and after centrifugate washing，then use HE dyeing，and assess the deformity ratio of sperm head,body,tail and SDI,TZI.Results The diversity ratio of deformed head and normal sperm have no significant difference before and after the washing procedure，but the ratio
4、of body,tail abnormity，SDI，TZI have disparity，and the difference have statistical significance.The direct film preparation recommend by WHO without washing have more foreign matter after staining,but didnt influence analyses.Conclusion These results indicate that sperm washing by centrifugate in mor
5、phology analyses has impact on SDI and TZI.But have no influence on the ratio of eumorphism sperm.The direct film preparation is applicable for the non-severity oligospermatism and the specimen of hypo-viscidity.Key words sperm;centrifugate;washing;morphology;staining在不孕夫妇中，男性因素导致的不孕约为 25%40%。常规精液分析
6、在评价精子质量方面应用广泛，精子形态作为精液参数的组成部分，是反映精液质量的重要指标1。精子功能与精子的正常形态密切相关。而畸形精子的增加，也是男性生育力受损的标志之一。正常形态率越低精子凋亡率越高。将精液常规与精子形态学分析相结合，有助于提高男性不育症的诊断率2。精子形态在评估精子受精能力及预测辅助生殖技术治疗结局方面，也发挥了很大作用。精子形态越差，其自然妊娠的能力就越低。由于各实验人员所采用的标准及判断不一致，在对精子形态分析方面结果出入颇大3。但是对精子形态做出准确的评估，对需要采用辅助生殖技术来满足其生育要求的畸形精子症患者非常重要，有助于找到适合的精液处理方法及行辅助生殖技术治疗时
7、选择最佳的受精方式4。本研究通过统计精子化验中各项畸形指标，为其形态学检测的标准化提供思路。1 资料与方法1.1 精液标本 47 例来自本中心就诊的男性不育患者，年龄在2439 岁，禁欲 27 天，手淫法取精。精液常规检查参考世界卫生组织精液分析手册(第 4 版)。入选标本的精子密度在(59.4239.67)106/ml。1.2 实验方法1.2.1 标本制备 精液标本在常规分析后直接涂片，若密度检查小于 20106/ml，取 1020 l 精液直接涂片;若密度高于 20106/ml，取 5 l 精液在载玻片上拉薄，空气中自然干燥。同份标本加入 5 倍体积的生理盐水，在 800 g 下离心 10
8、 min 去除精浆，轻弹试管使离心后的精子团重新悬浮于盐水中，取 2040 l 涂片。光镜下观察精子密度，以无精子重叠为准，过稀或过密需重新涂片。1.2.2 标本染色 方法采用快速苏木素-伊红染色法(HE)染色5，干燥后的涂片在 90%酒精中固定 30 min，流水冲洗后将涂片在苏木素中染 5 min，再次冲洗后在伊红溶液中染色 5 min，流水冲洗玻片后室温干燥。在油镜视野下观察并进行计数。1.2.3 分类标准 采用 Kruger 严格精子评分标准，每份标本连续计数 200 个精子，分别记录头部、体部、尾部畸形精子的百分率和正常形态精子比率。其中头部畸形中将大头畸形和小头畸形分别标记。最后统
9、计精子畸形指数和畸形精子指数。1.3 统计学方法 采用 SPSS 11.0 统计软件进行分析，统计资料以均数标准差(xs)表示，各项畸形以百分率表示，均数比较用 t 检验。P0.01 为差异有统计学意义。2 结果47 例非严重少精患者在离心前后分别计数头、体、尾部畸形精子比例，结果如表 1 所示。正常形态精子比率在离心洗涤前后无显著差异(P0.01)。头部畸形比率(包括大头畸形和小头畸形)也不受离心洗涤的影响(P0.01)。考虑到检测样本数量，但初步可得结论，离心后精子体部和尾部畸形率减少，SDI 与 TZI 也减小，差异具有统计学意义(P0.01)。3 讨论精子形态测定是常规精液分析中最重要
10、的临床指标之一。但精子形态又比较难测定准确和稳定。目前使用人工方法评价精子形态存在主观性，不同实验室甚至同一实验室内部检测结果的偏差广泛存在6。因此，减少操作中的不确定因素对形态分析的影响很重要。现大多男科实验室采用的是对精液标本均用生理盐水洗涤后再涂片分析。而离心力的作用对形态学的影响还不确定。有研究认为离心力的作用易使得精子细胞体形态发生改变7。本实验将精子在离心洗涤前后的形态做对比分析，发现离心后体部精子畸形及尾部畸形显著减少。因此可考虑在密度检验非严重少精的标本形态分析时按照 WHO 推荐的涂片方法直接涂片染色。表 1 离心前后计数头体尾畸形精子比例注：*P0.01有学者认为对于人工授
11、精来讲，未处理精液中正常形态精子百分率在很低的情况下均不影响 IUI 结局8。那么对于因男性因素而寻求辅助生殖技术帮助的患者来讲，形态学的准确判定便可以有助于选择最佳的治疗方式。离心步骤会去除死精子和杂质9，一定程度上使正常形态精子增加，在形态检测时就要考虑到这一点10。Garca-Herreros 等11认为精液洗涤可以影响精子头的大小，在快染的标本中尤其显著11。本实验中尚未观察到头部畸形受到影响。在 IVF 的治疗实践中发现，受精率低下(30%的卵子受精)和受精失败(所有卵子都不受精)的患者很常见(20%30%)。精子形态异常可能就是 IVF 受精率低下的一个重要因素12。有研究显示，受
12、精失败组中畸形精子比例显著高于受精组13，7%左右的精子形态严重畸形患者有精子-透明带结合反应缺陷14。文献报道正常精子形态率对顶体反应率15、IVF 受精率、卵裂率有显著影响，而对 IVF 或 ICSI 其他治疗结局尚无明显相关16。正常精子形态在 4%14%时卵子仍有 63.9%的受精率，而边缘性精液参数异常易导致受精失败17。因此对于男性畸形精子患者应严格评分标准，考虑畸形精子比率再行部分卵子 ICSI 以避免受精失败，同时因男方因素而采取 ICSI 治疗的患者就应充分考虑到边缘性精液参数。Chen 等18研究认为按照 WHO 的分析标准评估的精子参数对于IVF 来讲作用并不是很大。但是
13、 TZI 和 SDI 较其他参数更有价值18，19。Aziz 等20研究认为，SDI 对衡量不育男性尤其是精浆内 ROS 过高的精液是个重要的检测手段。统计 TZI 和 SDI 指数是否在离心前后具有显著性差异，可以相对的判断染色前操作对结果的影响。男科实验室的责任就是让检验参数更准确。本实验提示在染色过程中使用洗涤步骤对精液参数有一定影响，反映在 TZI 和 SDI 在离心洗涤前后均有统计学差异上(P0.01)。由于本实验观察的标本数量有限，缺乏大样本系统性对比，其对临床应用辅助生殖技术的指征影响作用需要在今后的工作中进一步深入研究。【参考文献】1 蒋敏，陈新敏，岳焕勋，等.精子形态学分析在
14、男性不育症诊断中的应用.中国优生与遗传杂志，2007，15(6)：106-107.2 李然伟，刘睿智，许宗革，等.精子凋亡与精子密度、活力、形态关系探讨.中国实验诊断学，2007，11(6)：776-779.3 岳焕勋，蒋敏，李福平，等.精索静脉曲张不育患者的精液质量和精子形态学观察.中华男科学，2005，11(12)：933-935.4 李志凌，谢文燕.辅助生殖技术中的精液优选处理.生殖医学杂志，2007，16(3)：209-212.5 刘德一，HW Gordon Baker.精子功能检测与男性不育诊治的新进展.中华男科学杂志，2007，13(2)：99-109.6 刘睿智，宋贺.计算机自动
15、精子形态分析仪(ASMA)对精子形态的分析.中国实验诊断学，2004，8(3)：311-313.7 张青松，文波，陈敏.体外处理对精子形态的影响及妊娠结局的临床观察.中国优生与遗传杂志，2007，15(7)：83-84.8 Karabinus DS，Gelety TJ.The impact of sperm morphology evaluated by strict criteria on intrauterine insemination success.Fertil Steril，1997，67(3)：536-541.9 Vijayakumar R，Ndubisi B，De Leon F
16、，et al.Sperm wash in three culture media：maximization of motile sperm recovery during swim-up incubation.Andrologia，1987，19(5)：579-584.10 Scott RT Jr，Oehninger SC，Menkveld R，et al.Critical assessment of sperm morphology before and after double wash swim-up preparation for in vitro fertilization.Arch
17、 Androl，1989，23(2)：125-129.11 Garca-Herreros M，Aparicio IM，Barn FJ，et al.Standardization of sample preparation，staining and sampling methods for automated sperm head morphometry analysis of boar spermatozoa.Int J Androl，2006，29(5)：553-563.12 崔险峰.应用严格精子形态学测定法评估精子形态对体外受精率的影响.中华男科学杂志，2006，12(9)：842-843
18、.13 师娟子，薛侠，张洲，等.畸形精子症与常规体外受精失败.中华男科学杂志，2009，15(2)：106-109.14 Liu DY，Baker HW.High frequency of defective sperm-zona pellucida interaction in oligozoospermic infertile men.Hum Reprod，2004，19(2)：228-233.15 李建平，钟影，吴东，等.人卵泡液诱导的顶体反应、精子形态与体外受精率的关系.中华男科学杂志，2006，12(7)：605-607.16 林典梁，孙艳，陈永艳，等.人精子顶体反应检测临床应用价值
19、探讨.海峡预防医学杂志，2006，12(3)：5-8.17 Kruger TF，Acosta AA，Simmons KF，et al.Predictive value of abnormal sperm morphology in in vitro fertilization.Fertil Steril，1988，49(1)：112-117.18 Chen X，Zhang W，Luo Y，et al.Predictive value of semen parameters in in vitro fertilisation pregnancy outcome.Andrologia，2009，4
20、1(2)：111-117.19 Wu Y，Xu HM，Zhang SY，et al.Sperm morphology does not influence fertilization rate in vitro.Zhonghua Nan Ke Xue，2008，14(7)：610-613.20 Aziz N，Saleh RA，Sharma RK，et al.Novel association between sperm reactive oxygen species production，sperm morphological defects，and the sperm deformity index.Fertil Steril，2004，81(2)：349-354.
