1、液相色谱 质谱联用技术测定无糖食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖作者：王浩 刘艳琴 杨红梅 郭启雷 史海良 阎龙宝【摘要】 建立了无糖食品中葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的高效液相色谱 串联四极杆质谱联用测定方法。本方法以水提取样品,以 Waters Carbohydrate Analysis 柱（300 mm3.9 mm, 10 m）分离，流动相为水 乙腈（1585， V/V） ，电喷雾负离子 MRM 模式检测。方法的检出限为 0.1 g/kg；线性范围为 2.5125.0 mg/L；加标回收率为 86.297.7；相对标准偏差为 3.1%8.7。 【关键词】 液质联用仪； 无糖食品;
2、 葡萄糖; 果糖; 蔗糖; 麦芽糖; 乳糖Abstract A LCMSMS method was developed for the determination of glucose, fructose, sucrose, maltose and lactose in sugarfree products. The mass spectrometer was operated in the negative mode using MRM. In this method, samples were extracted with water and chromatographic separat
3、ion was carried out using a Waters Carbohydrate Analysis column (300 mm 3.9 mm, 10 m) with a mobile phase of acetonitrilewater(8515, V/V). The limit of detection is 0.1 g/kg and the linear range was obtained from 2.5 to 125.0 mg/L. Overall recoveries were between 86.2% and 97.7%, and RSD value were
4、between 3.1and 8.7%.Keywords Liquid chromatographytandem mass spectrometry; Sugarfree products; Glucose; Fructose; Sucrose; Lactose1 引 言20 世纪 70 年代，无糖食品问世。最初的无糖食品只是除去食品中的蔗糖或是添加盐分，随着新型甜味剂的不断出现，无糖食品得到迅速发展，品种由最初的十几种发展到上万种。我国强制性标准 GB 134322004 预包装特殊膳食用食品标签通则中规定：只有符合糖(指所有的单糖和双糖)在固体或液体食品中的总含量低于 0.5 g/100
5、g(100 mL)，才可以在产品标签上标注“无糖” ；低糖食品的标准为糖(指所有的单糖和双糖)在固体或液体食品中的总含量低于 5 g/100 g(100 mL)。目前,检测食品单糖和双糖的方法有化学法 、高效液相色谱法等和质谱法9 。液相色谱法与现在使用的测定糖含量的菲林滴定法相比具有灵敏度好、检测速度快、适用范围广的特点，但是也存在方法检出限低，排除干扰能力差等缺点。目前，我国检测食品单糖和双糖的最新标准检测方法 GB/T2222.12008 食品中葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定 高效液相色谱法中规定：葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的检出限均为 0.4%，而且，不能消除无糖食品中广
6、泛添加的糖醇等甜味剂对单糖和双糖测定时产生干扰。因此，寻求简便、快速、准确、敏感性高、选择性好的无糖食品中单糖和双糖的检测方法，才能为我国无糖食品中单糖、双糖的日常监管工作提供技术支持，从而保障无糖食品的食用安全。本方法采用高效液相色谱 串联质谱技术同时测定和确证无糖食品中葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖，具有操作简单、灵敏度高、选择性好、测定周期短等优点。2 实验部分2.1 仪器与试剂6410 型串联三重四极杆质谱（美国 Agilent 公司） ， 配 Agilent 1200 型液相色谱仪； GL88b 型涡旋混合器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司） ； KQ5200 型超声波清洗仪（昆山
7、市超声仪器有限公司） ； TGL16M 型高速台式冷冻离心机（湘仪离心机仪器有限公司） 。 MilliQ 去离子水发生器（美国 MilliQ 公司)。乙腈（色谱纯） ；葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖均购自德国Dr. Ehrenstorfer 公司，纯度 98%99%。2.2 分析条件2.2.1 色谱条件 Waters Carbohydrate Analysis 色谱柱（300 mm3.9 mm i.d., 10 m；预柱： 12.5 mm4.6 mm i.d., 10m） ； 流速：1.0 mL/min；柱温：30 ；进样量：10 L；流动相：水 乙腈（1585， V/V） 。2.2.2 质
8、谱条件 离子源：大气压化学电离离子源(APCI)；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应检测；干燥气：N2 ；雾化气压力：344.8 kPa；干燥气温度：325 ；干燥气流速：9 L/min；汽化温度：350 。各种单糖、双糖的质谱分析条件参数见表 1。 表 1 果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖的质谱参数（略）2.3 样品处理2.3.1 饮料等液态食品 准确吸取样品溶液 2.5 mL 至 50 mL 容量瓶中，用水定容，涡旋混匀。准确吸取此溶液 5.00 mL 于 10 mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，涡旋混匀。用快速定性滤纸自然过滤（不易过滤的浑浊溶液转移至离心管中，以 5000 r/mi
9、n 离心 10 min，吸取上清液以 0.20 m 滤膜过滤） 。滤液过 0.20 m 滤膜，供液相色谱 串联质谱仪分析。2.3.2 糕点等固态食品 称取 2.5 g 样品 (精确至 0.01 g)，置于 50 mL 容量瓶中，用水定容，涡旋混匀，超声提取 30 min。准确移取提取溶液 5.00 mL 于 10 mL容量瓶中，用乙腈定容，涡旋混匀后用快速定性滤纸自然过滤。滤液过0.20 m 滤膜，供液相色谱 串联质谱仪分析。 3 结果与讨论3.1 样品前处理方法的优化NH2 色谱柱是以正相模式分离糖类物质的色谱柱，是将氨丙基单体键合到高比表面积的球形硅胶载体上而制得。在正相操作条件下，水比乙
10、腈的极性更强。因此，只有当测定溶液中乙腈含量50%时，才能保证色谱峰的峰形尖锐，否则色谱峰会展宽；其次，样品提取液与乙腈11(V/V)混合，可以有效去除提取液的蛋白质。综合以上考虑，实验采用节的样品处理方法，既能减小样品基质对测定结果的干扰，又能保证测定溶液中单糖和双糖色谱峰的完好，同时除去样品提取液中蛋白质。实验结果表明，本处理方法使样品中的葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖有较高的稳定性，并可获得满意的提取效率。3.2 质谱条件的优化采用直接进样方式分别将每种 1 g/L 的果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖标准溶液分别注入离子源中，在负离子检测方式下进行母离子全扫描，得到果糖、葡萄糖、蔗糖、
11、麦芽糖和乳糖的分子离子分别为m/z 179， 179， 341.1， 341.1 和 341.1。以每种糖的准分子离子峰为母离子，进行二级质谱扫描，采集全扫描的二级质谱图，得到碎片离子信息， 然后再对得到每种糖的二级质谱参数如破碎电压、碰撞能量等进行优化，使每种糖的定性离子与定量离子产生的离子对强度比例达到最大时为最佳，从而得到每种糖的最佳质谱参数(如表 1 所示)。3.3 色谱条件的优化3.3. 色谱分离条件选择 实验选择 NH2 色谱柱以正相模式分离糖类物质，选用水和乙腈的混合液为流动相。适当增加流动相中乙腈含量有助于果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的分离。实验发现，采用水 乙腈（1585
12、， V/V）时，可以较好地分离样品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖(如图 1所示)。3.3. 流速及进样量的选择本实验在 0.22.0 mL/min 范围内考察了流动相流速的影响, 发现流速为 1.0 mL/min 时，果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖出峰时间合适, 且峰形较好。大进样量可提高测定的灵敏度,但是容易污染色谱柱。实验发现,当进样量达到 10 L 时, 灵敏度能达到要求，且对色谱柱影响不大。3.4 线性范围与检出限用 50%(V/V)乙腈水溶液逐级稀释的标准工作液（2.5, 5.0, 25, 50.0 和 2.0 mg/L）分别进样 10 L，以样品的峰面积(y，Counts)对
13、浓度（x， mg/L）进行线性回归（表 2） ，线性范围为 2.5125.0 mg/L。用空白样品提取液进行加标实验，在信噪比均大于 3 的条件下能检出，将此添加量定为检出限。按照 2.3 节的步骤操作，进样量为 10.0 L 时，样品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的方法检出限均为 0.1 g/kg。表 2 果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的工作曲线回归方程和线性相关系数、检出限（略）3.5 方法的回收率和精密度每组准确称取无糖糕点样品 6 份，,每份 2.5 g, 共 3 组，分别定量加入果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖标准样品，添加水平分别为0.2， 1.0 和 5.0 g/kg，按供
14、试品溶液制备方法制备后进行测定, 结果见表 3。从表 3 可见，平均加标回收率为 86.2%105.5%，平均相对标准偏差为 2.37%8.72%（n=6） 。表 3 无糖糕点样品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖加标回收率（略）3.6 实际样品检测利用本方法对国内市场销售的 55 种无糖或低糖食品（包括：饮料、糕点、饼干、燕麦片、核桃粉、黑芝麻糊、口香糖等）进行检测。5 种糖的含量分别为; 果糖 09.06 g/kg；葡萄糖 051.05 g/kg；蔗糖0111.36 g/kg；麦芽糖 0230.74 g/kg；乳糖 045.73 g/kg。55 种无糖或低糖食品中，有 30 种食品的总糖含
15、量(包括果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖等) 小于 5 g/kg，占总数的 54.5%。实验表明，本法样品操作简单， 灵敏度高， 明显提高了检测效率，适用于快速测定无糖食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和乳糖。【参考文献】1 MA NaiLiang （马乃良）, XU SiZhao( 许思昭), CHEN MeiHong( 陈美洪), MO LingBin( 莫玲宾), WANG YanEr( 王燕儿). Modern Food Science and Technology(现代食品科技), 2006， 22（1）： 139141 LIU YuFeng （刘玉峰）, LI Li(李 黎), LI
16、 Dong(李 东) , WANG Jing(王 晶) , FANG Xiang(方 向), WU FangDi( 吴方迪). Food Science(食品科学), 2007， 28（3）： 293295 JIANG Min(姜 岷), LEI Dang(雷 丹), CHEN KeQuan( 陈可泉), LI Jian(李 建), YAO JiaMin( 姚嘉昊), WEI Ping(韦 萍). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学),2009, 37(4): 6056084 WANG JinXia( 王金霞), ZHAO Xia(赵 峡), YU GuangLi( 于广利
17、), LI GuangSheng( 李广生), HAO Cui(郝 翠). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学), 2009, 37(5): 6486525 HU ChangPing( 胡长平) . Anhui Chemical(安徽化工), 2005， 134（2）： 57586 WEI Yang（魏 泱）, GUO Liang(郭 亮), DING MingYu( 丁明玉).Chinese Journal of Chromatography(色谱 ), 2001， 19（6）： 5205227 DENG YongZhi( 邓永智), LI WenQuan( 李文权), YUAN DongXing( 袁东星). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学), 2006, 34(2): 169717018 MA XiaoGang （马晓刚）, YANG Lei(杨 磊). Chinese Journal of Spectroscopy Laboratory(光谱实验室), 2003， 20（6）： 9279299 ZHANG ZhenYing( 张珍英), DENG HuiMin( 邓慧敏), DENG QinYing( 邓芹英). Chinese J. Anal. Chem.(分析化学), 2008, 36(10): 14191422
