1、1,25 二羟维生素 D3 对哮喘小鼠气道重塑及基质金属蛋白酶9 表达的影响【摘要】 目的: 观察 1,25 二羟维生素 D3(VD)对哮喘小鼠气道重塑及其肺组织中基质金属蛋白酶9(MMP9) 表达的影响,探讨 VD 在哮喘治疗中的作用。方法: BALB/c 小鼠随机分为对照组、 哮喘组及 VD 组。卵蛋白致敏和激发建立慢性哮喘小鼠模型; HE 染色观察各组气道结构改变情况; 采用计算机图像分析系统评价各组气道重塑情况; 采用 RTPCR法检测各组的 MMP9mRNA 表达水平。结果: HE 染色提示哮喘组与对照组相比出现炎性细胞浸润增多、上皮细胞脱落及平滑肌细胞层增厚等气道重塑改变, 而 V
2、D 组可部分逆转上述病理改变; VD 组的支气管内壁厚度、平滑肌层厚度和平滑肌细胞核数显著低于哮喘组, 但仍高于对照组(P0.05); VD 组肺组织 MMP9mRNA 表达水平均明显低于哮喘组, 但仍高于对照组 (P0.05) 。结论: VD 干预可明显减轻慢性哮喘气道重塑的病理改变; 并可通过部分抑制肺内 MMP9 的表达来延缓气道重塑进程。 【关键词】 哮喘 气道重塑 1,25 二羟维生素 D3 基质金属蛋白酶9近年来气道重建在哮喘发病机制和治疗中的作用受到越来越广泛的关注, 它被认为是哮喘发病机制的一个重要环节和哮喘气道病理改变的重要基础, 同时也是哮喘治疗的一大靶向目标。1,25 二
3、羟维生素D31,25(OH)2D3 是维生素 D 的活性代谢产物, 它不仅是体内骨代谢及钙稳态的关键性调控因子, 同时还是一种第二类固醇激素, 能调节更为广泛的生理作用1 。但目前国内外尚无其调节哮喘气道重塑的相关研究报道。本试验旨在利用卵白蛋白（ovalbumin, OVA）激发的慢性哮喘小鼠模型, 探讨 1,25 二羟维生素 D3 对哮喘气道重构的干预作用, 为其在哮喘的临床应用提供新的理论依据。1 材料和方法1.1 材料 OVA 和 1,25 二羟维生素 D3 为美国 Sigma 公司产品; 氢氧化铝凝胶由上海生物制品研究所提供, TRIzol 试剂为美国 Invitrogen 公司产品
4、; Taq 酶及逆转录 RT 试剂盒为美国 Promega 公司产品。1.2 方法1.2.1 实验动物分组及哮喘模型的制备 46 周龄健康 BALB/c 小鼠 30 只(清洁级, 雄性, 体质量 1822 g), 由第四军医大学动物实验中心提供。随机将小鼠分为 3 组: 哮喘组、VD 组及对照组, 每组 10 只。哮喘组分别于第 0、 7、 14 天腹腔注射0.5 mL 致敏液(含 OVA 10 g 十氢氧化铝凝胶 2 mg)进行致敏;从第 21天开始为激发阶段, 将小鼠置于自制密闭箱内, 给予雾化吸入 25 g/L 的OVA 溶液 30 min, 其中第 21 天第 27 天每日雾化 1 次
5、, 而后第 28 天第 77 天隔天雾化 1 次, 共激发 8 周; VD 组以上述同样的方法用 OVA 进行致敏和激发小鼠, 并在每次激发前 1 h 分别予以腹腔注射 100 ng 的 1,25 二羟维生素 D3; 而对照组则用等量生理盐水代替 OVA 进行腹腔注射和雾化吸入。末次激发后 24 h 内处死动物, 取右肺组织用锡铂纸包裹,即刻-70冻存,用于总 RNA 及总蛋白抽提, 左肺经 40 g/L 多聚甲醛固定后, 石蜡包埋, 切片, 切片厚 4 m, 用于 HE 染色。1.2.2 肺组织形态学观察及图像分析 肺组织切片行 HE 染色, 400光镜下观察肺组织病理学改变; 另在 200
6、光镜下, 每只动物切片随机选取 5 个无软骨且平滑肌成环的完整细支气管横断面(无分叉及断裂), 且气管最小径 /最大径0.5, 采用leicaQ500 图像分析系统测定支气管基底膜周径(Pbm)、 气管内管壁面积(WAi), 平滑肌层面积(WAm)、 平滑肌细胞核数(N) , 并用 Pbm 将测量值标准化, 分别代表支气管内壁厚（WAi/Pbm） 、 平滑肌层厚度（WAm/Pbm）及平滑肌细胞核数（N/Pbm）, 以衡量气道重塑的程度。1.2.3 RTPCR 检测哮喘肺组织 MMP9 基因表达 采用 TRIzol 一步法提取肺组织总 RNA, 提取的 RNA, 经紫外分光光度计测量 A260
7、和 A280 的值, 判断其纯度, 并由 A260 吸光度计算出 RNA 浓度。按照 Promega 公司的逆转录试剂盒进行逆转录为 cDNA 后进行 PCR 扩增。MMP9 引物为: 上游 5GCCCTACAGCGCCCCCTACT3, 下游 5AGACACGCCCCTTGCTGAACA3, 扩增片段大小为 400 bp; 扩增反应参数设置为: 95预变性 5min; 95变性 45 s, 57.5退火 45 s, 72延伸 1 min, 35 个循环; 72保温 7 min。内参找 GAPDH 引物为: 上游 5AACGACCCCTTCATTGAC3, 下游 5TCCACGACATACTC
8、AGCA C3, 扩增片段大小为 191 bp, 扩增反应参数为 : 94预变性 5 min; 94变性 30 s, 55退火 30 s, 72延伸 2 min, 30 个循环; 72保温 7 min。取 PCR 产物置于 20 g/L 琼脂糖凝胶中电泳, 溴化乙锭染色, 电泳条带经凝胶成像分析系统扫描及分析, 并以内参照 GAPDH 条带进行标化, 计算 MMP9PCR 产物的相对定量。1.2.4 统计学处理 各组实验数据以 xs 表示, 采用 SPSS10.0 软件进行统计学分析。当方差齐性时, 用 oneway ANOVA 检验组间差异, 用 SNKq 检验进行两两间比较; 当方差不齐时
9、, 采用 KruskalWallis H 检验。2 结果2.1 各组激发后哮喘发作情况 哮喘多在激发后 30 min 内发作, 哮喘组小鼠出现口唇发绀、呼吸急促, 腹部翕动, 烦躁不安, 活动频繁等表现, 而 VD 组发作程度有所减轻, 对照组大鼠行动敏捷, 未见异常。2.2 肺组织病理学改变及图像分析 与对照组相比, 哮喘组小鼠气道壁及气道平滑肌明显增厚, 黏膜下水肿, 黏膜下层增宽, 黏膜皱褶增多,管腔狭窄, 有时可见黏液栓堵塞, 气道上皮细胞脱落, 杯状细胞增多, 黏膜下及管周有大量以嗜酸粒细胞为主的炎性细胞浸润（图 1） 。而 1, 25 二羟维生素 D3 的干预部分逆转了上述病变。图
10、像分析结果表明在支气管壁厚度(WA /Pi)、支气管壁平滑肌厚度(平滑肌面积/Pi)、支气管壁平滑肌细胞核数量(N /Pi) 3 个指标上, 哮喘组均显著高于其他各组（表 1）, 而 VD 组上述指标均较哮喘组明显下降, 但仍高于对照组(P0.05)。表 1 各组小鼠气道形态学指标(略) 2.3 肺组织 MMP9mRNA 的表达 RTPCR 结果显示, 哮喘组小鼠肺组织 MMP9mRNA 表达水平明显高于对照组, 而 VD 组的 MMP9mRNA 表达水平均较哮喘组显著下降, 但仍高于对照组表达水平（图 2）; 对各组条带进行半定量分析示, 对照组、 哮喘组及 VD 组 MMP9 mRNA 相
11、对定量分别为(0.570.08)、 (5.740.13)及（3.160.09）, 且两两比较均有统计学意义(P0.05)。3 讨论哮喘本质上是一种以 Th2 细胞免疫应答为主的慢性非特异性气道炎症, 它可引起气道损伤, 随之而来的是气道重建。气道重塑作为哮喘发病机制的一个重要环节, 被认为是哮喘慢性化、持续化、严重化的病理基础, 是哮喘中存在的不可逆性气道阻塞及气道高反应性的病理基础, 也是激素抵抗性哮喘的病理基础2, 3 。治疗哮喘必须与防治气道重塑相结合, 只有控制或者逆转了气道重构, 哮喘才可能得到真正意义上的控制。1, 25 二羟维生素 D3 是体内最重要的维生素 D 的活性代谢产物,
12、 它主要通过与其受体 VDR 的结合发挥生物学效应。新近研究明确 VDR 基因是哮喘的易感基因, 提示 1, 25 二羟维生素 D3 可能在某种程度上通过与 VDR 的配体 受体效应参与对哮喘的调节作用4 。目前研究发现 1, 25 二羟维生素 D3 在哮喘的免疫应答及慢性气道炎症发面均发挥着复杂的调控作用5, 6 。本实验在用 OVA 激发建立慢性哮喘小鼠模型时, 给予腹腔内注射 1, 25 二羟维生素 D3 进行干预, 结果显示与哮喘组比较, 1, 25 二羟维生素 D3 不仅减轻了哮喘的急性发作, 而且还部分逆转了哮喘小鼠气道重塑的多种病理改变。进一步应用图像分析软件对各组肺组织进行气道
13、形态学指标的检测, 显示 VD 组的支气管壁、 平滑肌厚度及细胞核数均较哮喘组明显降低。进一步证实 1, 25 二羟维生素 D3 对哮喘气道重塑的改善作用, 同时还提示其对气道平滑肌细胞有明显的抗增生作用。气道重塑过程也是细胞外基质重塑的过程, 上皮下纤维化形成及气道壁、 型胶原的沉积增加是气道重塑的重要病理改变, 在这一过程中 MMP9 发挥了重要的作用。MMP9 是基质金属蛋白酶家族的重要成员, 它与哮喘气道重塑关系密切, 是降解细胞外基质的最主要蛋白酶。TIMP1 是 MMP9 的生理性特异性抑制剂 , 生理情况下, 它以 11 的分子比例与 MMP9 结合, 特异性抑制 MMP9 的活
14、性7 。有研究表明, 哮喘时 , MMP9 过度表达, 造成 MMP9/ TIMP1 失衡, 不仅能导致细胞外基质(ECM) 的降解和沉积发生紊乱 , 而且还能诱导嗜酸细胞迁移及影响 SMC 增殖与迁移, 进而引发哮喘气道重建。因此抑制MMP9 表达被认为是改善哮喘气道重塑的重要机制之一8 。我们用PRPCR 法观察 1, 25 二羟维生素 D3 对慢性哮喘小鼠肺组织表达MMP9 的影响, 结果显示 VD 组小鼠肺组织中的 MMP9 mRNA 转录水平较哮喘组明显下降, 说明 1, 25 二羟维生素 D3 对哮喘 MMP9 的表达有良好的抑制作用, 提示 1, 25 二羟维生素 D3 可能部分
15、通过下调MMP9 表达, 调节 MMP9 与 TIMP1 的比例, 来干预哮喘气道重塑, 但尚需进一步研究以证实。目前 1, 25 二羟维生素 D3 在临床主要是用于防治哮喘因长期使用激素所致的骨质疏松症, 本研究阐明了 1, 25 二羟维生素 D3 在改善哮喘气道重塑中的积极作用, 为扩展其在哮喘防治中的临床应用提供了理论上的可能性。【参考文献】1Deluca HF, Cantorna MT. Vitamin D: its role and uses in immunologyJ. FASEB J, 2001, 15(14): 2579-2585.2Cakebread JA, Haitchi
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