1、Beagle 犬脊神经根组织化学染色的实验研究作者：岳喜军 曹晓建 卜寿山 【摘要】 目的 用 Fuminori 乙酰胆碱酯酶染色法鉴别脊神经根的性质，并观察脊神经根标本在室温下放置随时间的延长和液氮冷冻次数增加后染色结果的变化，为临床上快速地鉴别周围神经束的性质提供动物实验基础。方法 取 4 条 Beagle 犬的 T1S1 的所有新鲜脊神经根标本，分为A 组和 B 组:A 组标本在室温下每隔 1 h 做切片，连续 8 h，在显微镜下观察染色结果;B 组脊神经根取出后迅速保存在液氮里，间隔 10 min 取出室温下解冻 5 min 后做病理切片，观察染色结果，连续 10 次。结果 切片染色
2、0.5 h 后运动根出现红棕色染色，感觉根不被染色。室温下放置 5 h 后及液氮冷冻 7 次以后的切片，运动根染色明显减弱，切片出现神经标本的脆裂现象。结论 脊神经根的性质可以用 Fuminori 乙酰胆碱酯酶染色法快速准确地鉴别出来，越是新鲜的标本，染色效果越好。 【关键词】 乙酰胆碱酯酶；脊神经根；鉴别 在周围神经损伤后的神经修复中，难点之一是能否正确分辨出神经干内运动束与感觉束，现有的缝合方法由于不能实现两断端相同神经束正确缝合，严重影响了患者的神经功能恢复。本实验通过改进的Fuminori 乙酰胆碱酯酶染色法1对脊神经根的染色进行研究，鉴别脊神经根的性质，以期为实现神经两断端相同神经束
3、正确吻合、提高周围神经损伤修复后功能恢复率提供动物实验基础。 1 材料和方法 1.1 实验动物、仪器、试剂 1.1.1 实验动物 成年 Beagle 犬 4 条,雌雄各半,购自爱立默公司。 1.1.2 仪器 CM1900 恒温冷冻切片机（德国 Leica 公司） ， PHY-DHS-40X50-RC 型恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)，CHA 显微镜（日本Olympus 公司） ，GB303 微量天平（Metteler toldo 公司） 。 1.1.3 试剂 碘化乙酰硫代胆碱（acetyl cholinesterase iodide, 美国 Sigma 公司）,铁氰化钾(汕头西陇化工厂),柠
4、檬酸钠(汕头西陇化工厂),硫酸铜(上海振兴试剂厂),四异丙基焦磷酸亚胺(tetraisopropyl pyrophosphoramide, 美国 Sigma 公司)。 1.2 实验方法 1.2.1 染色原理 用乙酰硫代胆碱作底物， 经过组织中的乙酰胆碱酯酶（AchE ）的水解作用，放出硫代胆碱；硫代胆碱的游离硫氢基将铁氰化物还原成亚铁氰化物，后者再与铜离子形成不溶性的亚铁氰化铜，形成一种棕红色沉淀出现在酶活性部位。由于脊神经前根(运动根)中含有较多的 AchE 而后根(感觉根)中没有，故前根被染色而后根不被染色,从而达到鉴别的目的。 1.2.2 Fuminori 酶组织化学染色法试剂及配制配液
5、顺序:瓶 1 加入瓶 2,摇荡 12 min;管 1 加入瓶 2,混合 510 s;管 2 加入瓶 2,混合510 s;瓶 2 加入瓶 3,摇荡 5 min;管 3 加入瓶 3,混合 510 s。 将上述混合液(孵育液)放入 45温箱中孵育,使孵育液温度保持45。 1.2.3 标本制作及染色 取 4 条 Beagle 犬的 T1S1 的所有新鲜脊神经根标本，分为 A 组和 B 组。A 组的标本在室温下每隔 1 h 做切片，连续8 h，每次做完切片都及时染色。B 组的脊神经根取出后迅速放在液氮里冷冻，间隔 10 min 取出室温下解冻 5 min 后做病理切片,连续 10 次。制片要求：低温恒冷
6、切片(-20),厚 15 m，标本置于 10%甲醛钙液中固定 15 min，蒸馏水洗 3 次，每次 min。切片在上述孵育液反应 0.5 h后，显微镜下观察染色结果及拍照。 2 结 果 Fuminori 酶组织化学染色法结果出现较快, 在孵育 0.5 h 后就可以观察到大部分的脊神经前根神经纤维染色呈红棕颗粒,在室温下保存时间短和液氮冷冻次数少的脊神经前根标本染色更清晰（图 1、2） 。室温下放置 5 h 后（图 3）及液氮冷冻 7 次以后（图 4）的切片上观察到运动根染色明显减弱，染色结果变差。脊神经后根神经纤维均未出现着色。 3 讨 论 在周围神经损伤后的神经修复中，若能实现神经两断端感觉
7、束对感觉束、运动束对运动束正确吻合，将极大提高神经功能恢复率。因此术中如何快速准确地鉴别周围神经运动束和感觉束，成为显微外科研究中极其关注的难题。目前可供选择的区别神经束性质的方法有较早的形态学的神经束定位图2 、电刺激法3 、免疫组化法4 、计算机三维重建技术5等，但各因其自身存在的缺陷和不足而难以在临床上推广应用。如形态学的神经束定位图，因神经损伤后两断端易发生扭转，改变了原来的正常解剖位置而不能准确区别对合；用电刺激法，病人要保持清醒，对陈旧性损伤无反应，因电流扩布的影响准确性差；经典的Karnovesky 和 Root 酶组织化学染色6需要时间过长，2 h 后才能出现染色结果；免疫组化
8、法缩短了染色时间，但染色前准备过程复杂，假阳性率高，不能满足临床需要。Fuminori 酶组织化学染色法通过对孵育液配制的改进，使孵育液更加稳定，提高了酶反应温度，实验结果显示0.5 h 出现染色结果。 本实验结果显示：Fuminori 酶组织化学染色法可以比较快速地鉴别出神经根的性质，随着神经根标本放置时间的延长及冷冻次数的增加，染色效果变差，提示用于鉴别时新鲜的神经根效果好。本方法从时间角度来说，向临床应用迈进了一大步；但在实用上尚存在需要切取部分神经断端组织及原位对合问题，尚需进一步研究。 【参考文献】 1 Kanaya F. Mixed nerve suture facilitated
9、 by enzyme-staining techniquesJ. Tech Hand Up Extrem Surg, 2002, 6(3): 140-144. 2 Jabaley ME, Wallace WH, Heckler FR. Internal topography of major nerves of the forearm and hand: a current viewJ. J Hand SurgAm ， 1980，5(1): 1-18. 3 Gual JS. Electrical fascicle identification as an adjunct to nerve repairJ. J Hand SurgAm ， 1983，8（3）: 289-296. 4 严志强,王友华,张沛云，等.快速免疫组化法区分人周围神经束性质J. 中华显微外科杂志,1996,19（1）:3-5. 5 陈增淦，陈统一，张 键，等. 臂丛神经显微结构的计算机三维重建J.中华骨科杂志，2004，24（8）：462466. 6 Karnovsky MJ, Roots L. A “direct-coloring” thiocholine method for cholinesteraseJ. J Histochem Cytochem， 1964,12:219-221.
