1、Bcl-2、Bax 和 Caspase-3 在酒精性肝病大鼠肝组织中的表达和五田保肝液的干预作用作者：毕业东，苏金玲，安先凤，宋星星，范英昌【摘要】 目的研究 Bcl-2、Bax 和 Caspase-3 mRNA在酒精性肝病大鼠肝组织中的表达变化及五田保肝液对其表达的干预作用。方法选用健康清洁级雄性 Wistar大鼠 64只，随机分为对照组 10只;模型组、中药治疗组、阳性对照组各 18只。采用 62度白酒(10 mlkg-1d-1)、玉米油(2 mlkg-1d-1)、吡唑(25 mgkg-1d-1)混合物灌胃的方法建立大鼠酒精性肝病模型。12 周末处死大鼠，取肝组织采用荧光实时定量RT-PC
2、R法检测 Bcl-2、Bax 和 Caspase-3 mRNA的表达。结果模型组 Bcl-2基因表达较之对照组和中药治疗组显著性降低(P0.01)，与阳性对照组差异不明显(P0.05);模型组 Bax 、Caspase-3 基因表达较之其它各组均明显升高(P0.01);中药治疗组、阳性对照组 Bcl-2、Bax 、Caspase-3 基因表达与对照组相比无明显差异(P0.05);中药治疗组和阳性对照组 Bcl-2、 Bax 、Caspase-3 基因表达差异亦不具有显著性(P0.05)。结论大量饮酒可通过下调 Bcl-2基因的表达，上调 Bax 、Caspase-3 基因的表达促进肝细胞的凋亡
3、，导致肝损伤。而五田保肝液可通过调节 Bcl-2、Bax 和 Caspase-3 mRNA的表达，抑制肝细胞的凋亡，起到保肝护肝作用。 【关键词】 五田保肝液;Bcl-2;Bax;Caspase-3;酒精性肝病;大鼠酒精性肝病(Alcoholic Liver Disease，ALD)的发生与多种因素关系密切。其中，长期大量饮酒通过各种机制诱导的肝细胞凋亡是 ALD发生发展的重要原因。在长期的临床实践中证明五田保肝液(专利号：ZL021581703)对 ALD有预防和治疗作用，但是其具体发挥作用的靶点和机制不清。本文拟探讨五田保肝液是否对酒精性肝病大鼠肝细胞的凋亡具有干预作用。1 材料与仪器1.
4、1 动物清洁级健康 Wistar大鼠 64只，雄性，6 周龄，体质量(20020) g，由中国医学科学院实验动物所提供。1.2 材料和仪器实验用酒为 62度牛栏山二锅头，由北京顺鑫农业股份有限公司生产。五田保肝液由深圳市三九现代中药有限公司提供;阳性对照药物易善复(多烯磷脂酰胆碱胶囊)生产单位为赛诺菲安万特(北京)制药有限公司，批号/BN：D8099，规格 228 mg。RNA 提取试剂盒 RNA-Solv Reagent购自Omega公司;SYBR PrimeScript TM RT-PCR Kit 试剂盒购自 TaKaRa公司。ABI7300荧光定量 PCR仪购自美国 ABI公司，2700
5、 型 PCR System扩增仪为 Applied Biosystems公司产品。2 方法2.1 实验分组和动物模型制备适应性喂养 1周后，64 只大鼠随机分为 4组：对照组 10只，模型组、中药治疗组、阳性对照组各 18只。造模方法1：模型组、中药治疗组和阳性对照组大鼠均以 62度牛栏山二锅头酒(10 mlkg-1d-1)、玉米油(2 mlkg-1d-1)、吡唑(25 mgkg-1d-1)混合物灌胃,2 次/d,早晚各 1次。中药治疗组、阳性对照组、模型组大鼠于两次灌胃之间分别给予相当于成人等剂量的五田保肝液(1 020 mgkg-1d-1)、易善复(123.12 mgkg-1d-1)和相应
6、剂量的生理盐水灌胃，对照组则每日 3次以生理盐水灌胃。各组大鼠实验期间均予全价营养颗粒饲料喂养，自由进食饮水。造模时间为 12周。2.2 荧光实时定量 RT-PCR检测凋亡相关的基因表达2.2.1 引物的设计及合成 Bcl-2引物序列：forward：5-TGAACCGGCATCTGCACAC-3; revese：5-CGTCTTCAGAGACAGCCAGGAG-3;Bax 引物序列：forward：5-CGGCGAATTGGAGATGAACTG-3;revese：5-AGCAAAGTAGAAGAGGGCAACC-3;Caspase-3 引物序列：forward：5- CAGACAGTGGAA
7、CTGACGAT -3;revese：5- TTTCAGCATGGCGCAAAGTG -3。由上海生工生物工程技术服务有限公司使用美国 PE公司 391型 DNA自动合成仪合成引物。2.2.2 标本的留取和处理造模 12周末颈椎脱臼处死大鼠，大鼠处死前 12 h禁食水。处死大鼠后迅速剖腹取出肝脏，冰生理盐水冲洗，取肝右叶部分组织置于冻存管后迅速投入液氮中冷冻保存，以备检测分子生物学指标。所有手术器械均经 DEPC水浸泡和高压灭菌消毒处理。2.2.3 总 RNA的提取和检测按 RNA-Solv Reagent的操作说明书提取大鼠肝组织总 RNA，紫外分析及琼脂糖电泳检测总 RNA的纯度、浓度及完
8、整性。2.2.4 逆转录反应反应条件如下:反转录反应 85，15 min，反转录酶失活反应 95，30 s。2.2.5 荧光实时定量 PCR检测 Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表达反应条件如下:第 1步是预变性, 95, 30 s(1个循环)。第 2步是 PCR反应, 95, 5 s; 60, 31 s(40个循环)。反应结束后,使用 7300 system SDS software软件分析 PCR过程中样本的 CT(Threshold cycle)值，每个标本设 3个复孔，计算平均 CT值，每一次反应均设定阴性对照。采用 2-CT 计算各目的基因相对反应起始拷贝数，以 GA
9、PDH为内参。2.3 统计方法用 SPSS17.0统计软件包进行统计学分析，结果以s表示，各组数据比较采用 one-way ANOVA方法检验。3 结果3.1 各组大鼠一般情况比较对照组大鼠健康状况良好，整个实验过程无一只死亡。模型组大鼠精神萎靡，毛发干枯蓬乱，部分大鼠出现脱毛现象，食量减少，大便稀，小便黄。至造模结束，体质量增长不明显。至 12周末，因酒精误入气管死亡 3只，因急慢性酒精中毒死亡 7只。中药治疗组和阳性对照组大鼠情况好于模型组，精神较活跃，体质量增加较模型组快，均因酒精误入气管死亡 5只，因急慢性酒精中毒死亡 4只。3.2PCR 产物鉴定各产物的熔解曲线仅有 1个峰,说明为单
10、一片段扩增,熔解温度分别为 GAPDH 85.3,Bax 86.4,Bcl-2 为 84.6，Caspase-3为 83.9。3.3 各组大鼠肝脏组织 Bcl-2、Bax 和 Caspase-3 mRNA的表达模型组 Bcl-2基因表达较之对照组和中药治疗组显著性降低(P0.01)，与阳性对照组差异不明显(P0.05);模型组 Bax 、Caspase-3 基因表达较之其它各组均明显升高(P0.01);中药治疗组、阳性对照组 Bcl-2、Bax 、Caspase-3 基因表达与对照组相比无明显差异(P0.05);中药治疗组和阳性对照组 Bcl-2、 Bax 、Caspase-3 基因表达差异亦
11、不具有显著性(P0.05)。结果见表 1。表 1各组大鼠肝组织 Bcl-2、Bax和 Caspase-3 mRNA的表达情况4 讨论目前，酒精滥用和依赖已成为日益严重的公共卫生问题。大量长期饮酒可导致 ALD，在病理组织学上 ALD可分为酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化、酒精性肝硬化几种常见类型 2。近年来国内外对 ALD的发病机制进行了大量研究，认为乙醇和其代谢产物的直接毒性作用以及造成机体的代谢紊乱，自身抗体形成、过氧化反应、线粒体损伤、自由基的形成和氧利用障碍等均可引起肝损伤3。新近研究发现，细胞凋亡在 ALD的发生发展过程中发挥重要的促进作用4。凋亡是不同于坏死的一种细胞死亡形
12、式，是细胞在生理或病理信号刺激下启动自身凋亡基因发生的主动自杀行为。凋亡目前被认为是保持组织自稳态的一个基本过程,但是过度凋亡则会引起组织损伤，进而导致功能障碍。细胞凋亡受促进凋亡因子和抑制凋亡因子的共同调节，其中发挥最主要作用的是 Bcl-2家族和 Caspase家族。Bcl-2 家族和凋亡关系最密切的是 Bcl-2和 Bax。Bcl-2 蛋白发挥抗凋亡作用，而 Bax蛋白发挥促凋亡作用，二者作用的整合决定细胞的生死。单体的 Bax不能诱导细胞凋亡，其诱导细胞凋亡的方式一种是与Bcl-2结合成异源二聚体而抑制 Bcl-2的抗凋亡作用，一种是 Bax表达过量，形成同源二聚体，直接启动或诱导细胞
13、凋亡。如果 Bcl-2过量表达，则形成 Bcl-2同源二聚体，抑制细胞的凋亡5。综上所述，细胞内两类蛋白的含量和功能状态之间的平衡是细胞调控凋亡的重要机制，当 Bcl-2的含量高于 Bax时，抑制了细胞的凋亡;而当 Bax的含量高从而形成 Bax同源二聚体时，则细胞趋于凋亡。本研究发现，模型组大鼠 Bcl-2的表达水平比对照组显著降低，而 Bax的表达水平却明显升高，这时形成 Bax同源二聚体，加速肝细胞的凋亡，促进肝脏的损伤。而中药治疗组和阳性对照组的 Bcl-2、Bax 水平和对照组相比差别不具有显著性，提示五田保肝液主要是通过提高Bcl-2的表达，降低 Bax的表达来抑制肝细胞的凋亡，起
14、到保肝作用。Caspase 家族成员到目前为止已区分了 14种，根据它们假定的功能和同源顺序，Caspase 通常被分为 3组：凋亡启动因子、凋亡执行因子和炎性介导因子。凋亡执行因子包括 Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7。尤其是 Caspase-3在介导细胞凋亡的过程中发挥重要作用6。本研究另外发现，模型组大鼠 Caspase-3的表达显著高于对照组，因此可得出结论 Caspase-3的表达升高也是酒精造成大鼠肝细胞凋亡的另外一个分子机制。而中药治疗组和阳性对照组 Caspase-3的表达与对照组无明显差别，说明五田保肝液可以通过抑制 Caspase-3的上调而起到抑
15、制肝细胞凋亡的效果。但是，凋亡的调节是极其复杂的。新近研究证明，Bcl-2 可通过阻止 Caspase-3的激活而降低细胞凋亡的发生，一旦 Caspase-3被激活，Bcl-2蛋白将被 Caspase-3酶解成较短的 22kDa的片段，其功能发生了根本转变，抑制凋亡转换为触发凋亡7。由此可发现 Bcl-2家族和Caspase家族在调节凋亡上的作用是密切相关的。长期临床应用显示了五田保肝液有良好的降酶、降脂等治疗作用，观察各类脂肪肝 128例，4 周后结果显示其中 64例为观察组总有效率为95.31%(P0.01)，肝功能、血脂等血生化指标明显改善(P0.05,0.01),临床症状如肝区隐痛、乏
16、力、腹胀等改善率好于对照组(P0.05)。通过“清肝化湿、分化通经、解毒祛瘀”来实现保肝作用8。经过我们的研究结果表明，五田保肝液对酒精诱导的大鼠肝细胞凋亡的干预作用机制是复杂的，对 Bcl-2家族和 Caspase-3的表达均发挥了一定作用，一方面通过促进 Bcl-2的表达和下调 Bax的表达，提高Bcl-2/Bax的比率而发挥抗凋亡，进而保肝的功效，另一方面，Bcl-2 的表达提高也阻止了 Caspase-3的进一步激活，而 Caspase-3的激活减少也反过来使 Bcl-2的降解减少，这样一个级联反应最终使五田保肝液更有效地发挥抗肝细胞凋亡和保肝的功效。【参考文献】1陈宏辉,张明亮,阳学
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