1、BCA 法测肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌 SR膜蛋白浓度作者：叶兆伟，李洵，王海燕，李尽哲，承伟【摘要】 目的测定肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌膜蛋白浓度。方法蔗糖梯度离心法对肺动脉平滑肌膜蛋白进行提取;二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA )法测定膜蛋白浓度;G-6-Pase 定量试剂盒测定平滑肌肌浆网(SR)标志酶 G-6-Pase 活性。结果经测定 MCT 组和对照组G-6-Pase 活性分别为(19.52.41)IU/g 和(18.352.21)IU/g，明显高于肺动脉平滑肌组织匀浆 G-6-Pase 活性(1.230.14)IU/g 和(1.150.17)IU/g;测定
2、波长为 595 nm，在 0.0250.5 mg/ml 时，线性关系良好，r=0.997 6。结论提取的 SR 有较高纯度;BCA 法可以用于平滑肌 SR 膜蛋白浓度的测定。 【关键词】 野百合碱; 肺动脉高压; SR; BCA 法目前测定蛋白浓度有很多种方法，其中二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)法是近来广为应用的蛋白定量方法。其原理与 Lowry 法相似，即在碱性环境下蛋白质与 Cu2+络合并将 Cu2+还原成 Cu+。BCA 与 Cu+结合形成稳定的蓝紫色复合物，在 562 nm 处有高的光吸收值并与蛋白浓度成正比，据此可测算蛋白质浓度。与 Lowry 法相比，B
3、CA 法灵敏度高、操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。与 Bradford 法相比，BCA 法的显著优点是受杂质的影响较小，故本文选用 BCA 法对提取的样品进行蛋白浓度测定。1 材料与仪器1.1 动物健康成年 Wistar 大鼠，雄雌兼用，250300 g，由辽宁医学院实验动物中心提供。1.2 试剂 野百合碱(MCT)、Tris、马来酸、二硫苏糖醇(DTT)、苯甲基磺酰氟(PMSF)(美国 Sigma 公司);抑肽酶(aprotinin)、亮肽素(leupeptin)(Amresco Solarbio 公司);BCA 蛋白测量试剂盒(北京天来生物医药科技有限公
4、司);葡萄糖-6-磷酸酶定量试剂盒(广州天河天一医药保健品公司);其它试剂均为国产分析纯。1.3 仪器 ULTRA. Pro 80 型高速低温离心机(美国 SORVALL 公司); 7170A 型全自动生化分析仪(日本日立公司);ELX-800 型酶标仪(美国宝特公司)。2 方法2.1 溶液的制备12.1.1 匀浆液 30 mmolL-1 Tris-马来酸(Tris-maleate)，3.0 molL-1 蔗糖，3 mmolL-1MgCl2，2 mmolL-1 二硫苏糖醇(DTT)，1 molL-1 胃蛋白酶抑制剂(pepstatin)，1 molL-1 亮肽素(leupeptin)，2.4
5、U 抑肽酶(aprotinin)，0.1 mmolL-1 苯甲基磺酰氟(PMSF)，1 molL-1 抗坏血酸钠(Nasocorbate)，pH 7.2。2.1.2 萃取液 30 mmolL-1 Tris-maleate， 0.3 molL-1 蔗糖，0.6 molL-1 KCl，1 molL-1 leupeptin，0.1 mmolL-1 PMFS，pH 7.2。2.1.3 储存液 30 mmolL-1Tris-maleate，0.3 molL-1 蔗糖，1 molL-1leupeptin， 0.1 mmolL-1 PMSF，pH 7.2。2.1.4 BCA“工作液”按 50 体积 BCA
6、试剂 A 溶液加 1 体积 BCA 试剂 B 溶液配制，充分混匀备用。2.2 大鼠肺动脉高压的建立2健康成年 Wistar 大鼠腹腔一次性注射 MCT 生理盐水溶液(60mgkg-1)，饲养 21 d 后取出肺和心脏。剪下右心室，左心室、分离室间隔，称重，计算右心室/(左心室+室间隔重量)RV/(LV+S)之值。2.3 SR 的提取及纯度鉴定2.3.1 SR 的提取参照文献3采用差速离心法制取肺动脉 SR。正常与 PAH 大鼠各 10 只，雄雌不限，体质量 250300 g。无菌生理盐水配成 20%乌拉坦溶液，按 0.5 ml/100 g 体重的剂量进行腹腔麻醉，麻醉后快速开胸取出心肺组织，分
7、离肺动脉上的结缔组织，尽可能向肺内部延伸，剪断取出，立即置于-80保存。取冻存的 MCT 组和对照组肺动脉，称重为 0.669 5 g 和 0.252 7 g。按照重量体积(V/W)=15 加入 0左右的匀浆液冲洗。然后将肺动脉快速切碎(1mm3)，匀浆，完毕后收集匀浆液于冷冻离心试管中，低速离心(3 800g，20 min)，所得上清液用于制备 SR。取上清液高速离心(4，12 000g，20 min)，离心毕收集上清液于-80保存。将离心后保存的上清液解冻，倒入低温高速离心试管中，冷冻高速离心机离心 30 min(4，143 000g)。倾去上清液，保留沉淀，分别加入 6 ml 萃取液，充
8、分振荡，使其混匀。配平，在原来转速、温度不变的情况下，离心 45 min。离心毕，倾去上清液，保留沉淀，称重记录。离心管中加入储存液各 5 ml，振荡混合均匀，转移至提前准备好的青霉素小瓶中，分装后以超低温冰箱速冻，-80保存。2.3.2 SR 的纯度鉴定4利用 7170A 型全自动生化分析仪和 G-6-Pase 定量试剂盒，对经蔗糖差速离心法提取的对照组和 MCT 组 SR 标本中SR 标志酶 G-6-Pase 活性进行检测。2.4 BCA 法测蛋白浓度取试剂盒中蛋白标准品-牛血清蛋白10l，用 0.9%生理盐水 90 l 稀释，使终浓度为 0.5 mg/ml，此即为标准品稀释液。取标准品稀
9、释液按 1，2，4，8，12，16，20 l 加入到 96 孔平板的标准品孔中，加 0.9%NaCl 补足到 20 l。另取上述 MCT 组及对照组 SR 的制备品各 10 l 加入到 96 孔板的样品孔中，亦加 0.9%NaCl 补足到 20 l。标准品孔和样品孔各加入 200 lBCA 工作液，轻微振荡，混匀于37恒温水浴中温育 30 min。取出平板于酶标仪上测吸光度，测定波长为 570 nm 和 595 nm。3 结果3.1 大鼠肺动脉高压的建立见表 1。MCT 组右心室/(左心室+室间隔重量)与对照组相比有显著性差异(P0.01)，说明注射 MCT 大鼠右心室肥厚，具有明显的肺动脉高
10、压的病理生理改变。表 1 MCT 和对照组 RV/(LV+S)3.2 提取的 SR 纯度见表 2。从表 2 中数据中可以看出提取的 SR 有较高的纯度。表 2 标志酶 G-6-Pase 活性3.3 测定的蛋白浓度以吸光度为纵坐标(Y)、标准品质量为横坐标(X)，进行回归运算( 图 12)，求得曲线方程分别为 Y=1.7110-2X+8.0010-3，r=0.983 8;Y=4.7410-2X+3.8010-3，r=0.997 6。当波长为 595 nm 时，吸光度与标准品质量相关系数好，r 为0.997 6。故选用波长为 595 nm 的方程。经计算 MCT 组和对照组 SR 的制备品重量分别
11、为 12.282 7 g 和 6.797 5 g，则浓度分别为 0.614 3 g/l 和 0.339 9 g/l。此数据说明提取的 SR 蛋白浓度较高。图 1 570nm 处标准品质量与吸光度关系曲线方程图 2 590nm 处标准品质量与吸光度关系曲线方程4 结论通过以上数据，MCT 组右心室/(左心室+室间隔重量)与对照组相比有显著性差异(P0.01)，说明注射 MCT 大鼠右心室肥厚，具有明显的肺动脉高压的病理生理改变;经测定 MCT 组和对照组 G-6-Pase 活性分别为(19.52.41)IU/g 和(18.352.21) IU/g，明显高于肺动脉平滑肌组织匀浆 G-6-Pase
12、活性(1.230.14)IU/g 和(1.150.17)IU/g，说明提取的 SR 有较高的纯度;当波长为 590 nm 时，线性关系良好。通过计算结果表明用以上的方法提取，比较可靠，方法可行。MCT 是野百合科植物野百合中提取的生物碱，本身没有活性，通过给大鼠皮下注射，在肝脏中代谢形成具有生物活性的脱氢产物-野百合碱吡咯，后者在血流通过肺脏时沉积于肺小动脉壁及肺毛细血管。血管内皮细胞(Ec)覆盖管腔 60%70%的内表面，其生理作用不只是单纯的血管内衬。近年来的研究表明，内皮是一个代谢极为活跃的组织，它可合成多种血管活性因子，在受到 MCT 损伤时，这些活性因子会发生改变，引起继发性的血管构
13、型改变，从而导致肺动脉压升高，所以 MCT 腹腔注射法是建立肺动脉高压模型的常用方法【参考文献】1 吴 乐，张缪佳，高 蓉，等.骨骼肌型 ryanodine 受体放射配基分析法的建立J.中华 核医学杂志， 2003，23(3):171.2 孙燕妮，刘忠令.野百合碱诱发肺动脉高压大鼠血管活性物质的变化J.中国药理学通报， 2001，17(5):573.3 Valdivia H， Fuentes O， Elhayek R，et al. Activation of the ryanodine receptor Ca2+ release channel of carcoplasmic eticulum by a novel scorpion venomJ.Bial Chem，1991，266:19135.4 承 伟，叶兆伟，王佩琪，等.肺动脉高压模型大鼠肺动脉平滑肌 RyR 结合特性及基因 C-末端序列的研究J.中国药理学通报，2008，24(10):1306.
