1、CD4+调节性 T 细胞的表面分子标记物和作用机制初探【摘要】 胸腺来源的 CD4+CD25+调节性 T 细胞在外周免疫耐受机制中发挥着重要作用。其表面表达多种分子标志，包括 CD25(IL-2 受体 链)、细胞毒 T 细胞相关抗原-4(CTLA-4)、肿瘤坏死因子受体家族相关基因(GITR)和程序性死亡 1(PD-1)、叉头翼螺旋转录因子(Foxp3)等膜分子。然而这些细胞表面分子均非调节性 T 细胞的特征性标志，不能据以区分调节性 T 细胞与活化的 T 细胞。寻找合适的表面分子标记物将是对调节性 T 细胞进行深入研究的关键步骤。本文就近年来关于 CD4+调节性 T 细胞的分子标记物及作用机
2、理的研究做一综述。 【关键词】 CD4+调节性 T 细胞;分子标记物;Foxp3调节性 T 细胞(regulatory T cell，Tr)能够阻止针对自身抗原的炎症反应，并能限制自身免疫病的发展。这些具有免疫调节作用的细胞以两种形式存在，一种是体内自然存在的细胞，另一种是经诱导后产生的细胞。本文就近年来关于 CD4+调节性 T 细胞的分子标记物及作用机理的研究做一综述。1 CD4+调节性 T 细胞的起源CD4+ CD25+ Tr 细胞是目前研究较多的亚型，其他还有 Th3 和Tr11。CD4+ CD25+ Tr 细胞在自身免疫耐受中起重要作用，它来源于胸腺的 CD4+CD25-T 细胞。在胸
3、腺的自然选择过程中，T 淋巴细胞受体(TCR)与低密度的 MHC-lI 类肽复合物或胸腺内皮细胞递呈的外周自身肽间高亲和力的反应介导 CD4+CD25+Tr 细胞的分化发育。此外，最近发现当未成熟淋巴细胞在胸腺中经历选择时，对自身 MHC/抗原肽分子亲和力较高的一群 CD4+T 细胞被“部分活化” ，并获得其他一些特性，发育成为具有免疫抑制功能的 CD4+CD25+Tr 细胞，这种选择途径被称为“另类阴性选择” 。Tr1 与 Th3 是另外两类比较常见的调节性 T 细胞。Tr1 的主要特征是：分泌高水平的 IL-10，低水平的 IL-2，中度水平的 TGF-、IFN 和 IL-5。Th3 区别
4、于 Tr1 主要在于其分泌高水平的 TGF-。需要指出的是,CD25 分子不能将 CD4+CD25+Tr 细胞与 Tr1、Th3 细胞区别开来。前者组成性表达 CD25，后者在 T 细胞活化后也表达 CD25，但 CD4+CD25+Tr 细胞是源于胸腺的一个独特的 T 细胞亚群，而 Tr1、Th3 细胞则是在外周生成的。多数情况下，Trl、Th3 是通过抗原反复刺激诱导产生的。在 IL-10 存在的条件下，慢性激活 CD4+T 细胞可诱导 Trl 的产生,口服 IL-4 及 MBP 可诱导 Th3 的产生。2 CD4+调节性 T 细胞的分子标记物CD4+CD25+Tr 细胞表面表达多种分子标志
5、，包括 CD25(IL-2 受体 链)、细胞毒 T 细胞相关抗原-4(CTLA-4)、肿瘤坏死因子受体家族相关基因(GITR)和程序性死亡 1(PD-1)等膜分子。然而这些细胞表面分子均非Tr 的特征性标志，不能据以区分 Tr 与活化的 T 细胞。Hori 等发现Foxp3(forkhead/winged helix transcription factor 叉头翼螺旋转录因子)在 CD4+CD25+调节性 T 细胞中特异性表达，且对该群细胞的发育和功能起重要作用。Foxp3 可在一定程度上反映 CD4+CD25+Tr 的水平和活性2。但也有学者发现 Foxp3 表达并非 CD4+CD25+
6、Treg 的激活信号。活化的 CD4+CD25+Tr 不表达 Foxp3。Foxp3 不仅在 CD4+CD25+T 细胞表达，也在激活的 CD4+CD25-T 细胞、CD8+T 细胞表达。在小鼠中 Foxp3 只特异性地表达于胸腺和外周血的 CD4+CD25+ Tr，可作为 CD4+ CD25+ Tr 的一个特异性标志。然而人类的 Foxp3 除在 CD4+CD25+Tr 上表达外，在 TCR刺激时，其他非调节性 T 细胞也表达，因此 Foxp3 在人类 CD4+CD25+Tr上的表达并不具有特异性，Foxp3 表达的量并不一定代表 Tr 的量3。与人类不同，小鼠的 T 细胞在 TCR 刺激时
7、 Foxp3 表达并不增加，但在TGF- 存在时 Foxp3 表达增加，而且与调节功能相关的表面标志，如CD25、CTLA-4、GITR 均表达4。Foxp3 缺陷的小鼠缺乏调节性 T 细胞，导致免疫调节障碍和自身免疫紊乱。在人类 X 连锁的 Foxp3 基因的突变可以导致免疫调节缺陷、多种内分泌病和 X 连锁自身免疫综合征。Foxp3可以封闭 Rel 家族转录因子 NF-AT 和 NF-B 的作用，诱导他们的靶基因，从而发挥 IL-2 的转录抑制子的作用5，6。序列分析发现在 Foxp3 位点上有 3 个高度保守的非编码区：Foxp3 启动子区、TGF- 传感器区、调节性细胞特异性脱甲基作用
8、区(TSDR)7。天然的调节性细胞和诱导的调节性细胞的 TSDR 的甲基化作用是不同的。天然的调节性细胞 TSDA 是完全的甲基化，而诱导的 TSDR 甲基化作用与活化的传统的 T 细胞类似8，9。关于人类 Foxp3+CD4+T 细胞的基因表达、表现型、抑制功能的研究结果不尽相同。近来 Sakaguchi 等人10对 CD45RA 和 CD45RO 进行了研究，发现 CD45RA 可以作为 Foxp3lowT 细胞的表达标志，而Foxp3+CD45RO+ T 细胞属于效应性调节性 T 细胞，具有很强的抑制功能。最近的研究1113表明 miRNA 对 Tr 抑制具有重要的调节作用。miR-15
9、5 和 miR-146a 在鼠的 Foxp3 依赖的 Tr 上高表达，刺激后在效应性 T细胞和骨髓细胞上暂时上调。miR-155 和 miR-146a 抑制细胞因子信号转导抑制剂(SOCS)1 的表达，他对 STAT1 具有关键的阴性调节作用。miR-146a 主要是控制 Tr 调控 Th1 应答的能力14。研究发现 Foxp3 不仅表达在 T 细胞上，在胰腺癌细胞上也发现 Foxp3 的 mRNA 和蛋白。在体内胰腺癌细胞是 T 细胞增殖的有效抑制剂。Foxp3 表达的减少部分地逆转了胰腺癌细胞的抑制活性15。Moo-Young 等人16把新鲜分离的 CD4+CD25-效应性 T 细胞和胰腺
10、癌细胞(Panc89,Colo357)共同培养，TCR 诱导的扩增被抑制。但是目前还不知道这种抑制是由 Foxp3+肿瘤细胞直接作用的，还是由于某些效应性 T 细胞转化成了 Tr1 或 Th3 间接作用的。也有报道17认为 CDl27 可以作为调节性 T 细胞的一个特异性标志，在 CD25 表达时，CDl27(IL-7 受体的 链)可以区别 Tr 和活化 T 细胞。Tr 应为 CDl27 低表达(CDl27low)，而活化的效应 T 细胞为 CDl27 高表达(CDl27high)。Liu 等18运用微点阵基因表达谱技术发现，CD4+CD25+细胞表面 CD127表达下调，而大部分 CD4+F
11、oxp3+T 细胞表面均为 CD127 低表达，且体外具有抑制活性。近来有研究19，20表明 GARP 或 LRRC32 可能是调节性T 细胞的特异性活化标志。GARP 是 TCR 反复刺激产生的一种 Toll 样受体。它被认为是人类 CD4+CD25highFoxp3high 调节功能的补充。调节性 T 细胞上 si-RNA 介导的 GARP 的下调导致了抑制能力的下降;而非调节性 T 细胞上的过分表达也能发挥类似于调节性 T 细胞的抑制功能，因此提示GARP 在活化的调节性 T 细胞上发挥重要的功能2123。3 调节性 T 细胞的作用机制尽管付出了很大的努力，但是调节性 T 细胞抑制效应性
12、 T 细胞的作用机制还不十分明确，可能涉及抑制性细胞表面分子和抑制性细胞因子。3.1 抑制性细胞表面分子的调节作用Tr 细胞发挥抑制作用是细胞因子非依赖的，而主要依赖于细胞间直接接触，并通过 TCR 来激活抑制性细胞。参与 Tr 细胞接触抑制的重要分子之一为该细胞表达的 CTLA-4。Tr 细胞活化后 CTLA-4 的表达增加，并持续表达。CTLA-4 分子胞浆区可与磷酸酶 SHP-1 及 SHIP 结合，对CD4+及 CD8+T 细胞活化均有负调节作用。CTLA-4 与 B7 配接后，其胞内段携带的 ITIM 传递抑制信号，抑制 T 细胞的增殖和活化。用抗 CTLA-4 单抗可阻断 Tr 细
13、胞的抑制作用。调节性 T 细胞上表达的 CTLA-4 可以刺激树突状细胞表达吲哚 2，3-双加氧酶(IDO)，分解色氨酸 24。但 CTLA-4 缺陷小鼠的 Tr 细胞也能发挥某种程度的抑制作用25。因此，CTLA-4在 Tr 细胞功能中的作用还需进一步研究。LAG-3 是 CD4 相关的蛋白，在调节性 T 细胞上高表达。LAG-3 与 APCs 上的 MHC II 类分子结合，从而减弱活化的效应性 T 细胞的功能。因此，APCs 或 DC 在抑制效应性 T 细胞功能上发挥重要作用26。CD4+CD25+Tr 细胞所表达的膜型 TGF- 也可能是其介导免疫抑制功能的重要分子之一，这不同于 Tr
14、 细胞产生的分泌型TGF-。TGF- 隐性相关肽(LAP)在活化的调节性 T 细胞表面表达并发挥抑制分子的作用。LAP 的表达需要 GARP，他们在调节性 T 细胞表面相互结合。GARP 作为 LAP 的转运子，把 LAP 带到免疫应答的部位，释放 TGF-。CD28 分子也是参与接触抑制作用的分子之一，例如，加入抗 CD28 抗体不仅能明显加强 CD4+CD25-T 细胞的反应，还可几乎完全消除CD4+CD25+Tr 细胞的抑制作用。此外，GITR(glucoconicoid-inducedTNFR)也参与接触抑制机制。GITR 是 TNF 受体超家族成员之一，抗 GITR 单抗能阻断 CD
15、4+CD25+Tr 细胞的抑制功能。3.2 细胞因子的调节作用Tr 细胞分泌的两个重要的细胞因子为 IL-10 和 TGF-。其中以IL-10 对效应性 T 细胞的抑制作用占主导，通过 IL-10 对效应性 T 细胞的抑制作用强于通过 TGF-。IL-10 是 CTL 分化因子及 B 细胞活化因子，在天然免疫过程中是重要的负调节因子。它抑制巨噬细胞分泌 TNF、IL-1、IL-6 和趋化因子，抑制巨噬细胞对 T 细胞的辅助作用。IL-10 基因敲除的小鼠易发生炎症性损伤，其原因之一可能在于巨噬细胞的激活失去了控制。IL-10 可直接抑制 IL-2 的产生。CD25 分子即为 IL-2R 链，C
16、D25+T 细胞介导抑制作用的机制之一就是被动地吸收由效应细胞产生的IL-2。有高浓度的 IL-2 存在时，Tr 细胞可出现明显的经 TCR 介导的增殖反应。当其不依赖于 TCR 的刺激因素刺激时，Tr 细胞的反应水平正常。IL-l0 还具有抑制前炎症细胞因子的产生，抑制抗原特异性 T 细胞的激活，抑制单核细胞表达 MHC-1I 类抗原和辅助刺激分子，抑制单核细胞和巨噬细胞产生 NO 等功能。给予外源性 IL-l0 能够使双阴性 Tr 细胞对凋亡易感，并且使它们失去抑制功能。TGF- 在免疫调节与耐受中的重要性已经逐步被认识。TGF- 的作用主要有以下几方面：(1) TGF- 能够抑制包括 T
17、 细胞、B 细胞、巨噬细胞等在内的多种细胞，并且 TGF- 产生量的增加与阻止自身免疫病的发展及自身免疫病的恢复有关;(2)TGF- 能与 CTLA-4 协同作用终止免疫反应;(3)Th0、Th1 及 Th2 细胞亚群在与CTLA-4 交叉连接的情况下都能分泌 TGF-;(4)Tr 细胞分泌的 TGF- 不仅能对效应细胞发挥抑制作用，也能对记忆性 T 细胞发挥抑制作用;(5)TGF- 可与其他抑制性分子一起作用，在免疫特赦部位维持一种稳定状态，在其他器官稳定状态的维持中可能也有重要作用;(6)TGF- 下调黏附分子，并且抑制白细胞向内皮细胞的黏附;(7)TGF- 还有一个明显的作用就是直接抑制
18、 IFN 的产生。用 TGF- 处理过的 CD4+T 细胞在葡萄球菌肠毒素(SEB)的刺激下，产生 IFN 的数量较之没有用 TGF- 处理过的CD4+T 细胞明显减少。此外，在实验中为了增加抗体的产生，需要在培养开始时加入抗 TGF- 抗体，这表明 TGF- 是调节早期 T 细胞的活性而不是 B 细胞的分化。大量 Tr 细胞产生的高水平的 TGF- 能够抑制 IgG的产生，少量 Tr 细胞产生的低水平的 TGF- 只能在短距离以细胞接触的方式发挥抑制作用。另外，有研究表明 IL-35(属于 IL-12 家族)主要由调节性 T 细胞产生。IL-35 缺乏的调节性 T 细胞的抑制功能下降27。表
19、达 IL-2 高亲和力受体 链的调节性 T 细胞可以和效应性 T 细胞产生的IL-2 结合。细胞因子缺乏诱导的凋亡在调节性 T 细胞抑制免疫应答中也发挥重要作用28。高浓度的 IL-2 和 IL-15 可以完全消除调节性 T 细胞的免疫抑制作用，而 IL-4 和 IL-7 的结果不同。综上所述，CD4+调节性T 细胞在正常人体稳态的维持，在肿瘤、器官移植、自身免疫性疾病及病毒感染等病理状态下都起着重要作用。因此，进一步深入研究 CD4+调节性 T 细胞有重要意义，随着对 Tr 研究的深入，Tr 也许会为人类疾病的治疗提供新的靶点。【参考文献】1 Hoglund P. Induced perip
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