1、CD40LIg 基因修饰骨髓间充质干细胞对异种胰岛移植排斥反应的抑制作用张剑 张琪 张英才 朱焕兵 汪国营 杨扬【摘要】 【目的】 探讨白细胞分化抗原 40配体免疫球蛋白(CD40LIg)基因修饰骨髓间充质干细胞(MSC)对异种胰岛移植排斥反应的抑制作用?【方法】 建立 Wistar-SD大鼠异种胰岛移植模型,用携带分泌型 CD40LIg基因的重组腺病毒感染的 MSC进行干预治疗?取糖尿病大鼠 45只,随机分为 3组(每组 15只):对照组植入胰岛细胞;单纯 MSC组植入 MSC和胰岛细胞;基因转染 MSC组植入 CD40LIg基因转染的 MSC和胰岛细胞?观察糖尿病大鼠胰岛移植后生存情况?血
2、糖变化和移植物病理形态学改变,检测移植物 CD40LIg和胰岛素的表达以及移植大鼠细胞因子水平变化?【结果】 糖尿病大鼠血糖平均在移植后 2 d恢复正常,对照组血糖平均在移植后 7 d升高,单纯 MSC组和基因转染 MSC组血糖分别在 20 d和 47 d升高?对照组?单纯 MSC组和基因转染 MSC组,移植物存活时间分别为(9.5 3.2)d?(25.2 5.3)d和(53.6 7.5) d,各组间比较具有显著差异(F=5.362,P 0.05);移植糖尿病大鼠生存时间分别为(24.1 6.8)d?(51.7 7.9)d?(95.2 12.7)d,各组间比较差异具有显著性(F=6.821,P
3、 0.05)?对照组在胰岛移植后 7 d内,IL-2 和 TNF- 的水平均急剧上升,IL-4 和 IL-10的水平较移植前显著下降(P 0.01)?两个治疗组移植物内均可见成片的胰岛细胞团,未见淋巴细胞浸润,转染 MSC组移植物内可见 CD40LIg和胰岛素的表达?【结论】 CD40LIg基因修饰骨髓间充质干细胞可以延长胰岛移植物的存活时间,抑制大鼠异种胰岛移植的排斥反应? 【关键词】 骨髓间充质干细胞; CD40LIg; 胰岛移植; 糖尿病Abstract: 【Objective】 To investigate the effects of cluster of differentiati
4、on 40 ligand immunoglobulin (CD40LIg) modified bone marrow mesenchymal stem cells (MSC) on the rejection of rat islet xenografts. 【Methods】 The islet xenografts model was established with islet cells of Wistar rat transplant under the left kidney capsule of diabetic SD rat. MSC were infected with th
5、e recombinant adenoviruses containing CD40LIg gene as intervention treatment. Forty-five modeled diabetic rats were randomly divided into three groups with 15 in each: only islet cells were transplanted to rats in control group (A), islet cells and MSC were transplanted to rats in MSC group (B) and
6、islet cells and MSC infected with CD40LIg gene were transplanted to rats in transfected MSC group (C). The blood sugar and the survival of transplantation rats and grafts were observed after transplantation. The morphological changes of grafts were observed. Expression of CD40LIg and insulin were de
7、tected by immunohistochemical staining and cytokines were quantified by ELISA. 【Results】 (1) The blood sugar of transplantation rats decreased to normal level on day 2 after transplantation. The average level blood glucose of control group (A), MSC group (B), transfected MSC group(C) increased on da
8、y 7,20,47, after transplantation respectively. (2) The grafts of group A, B, and C survived for (9.5 3.2), (25.2 5.3), and(53.6 7.5) days, respectively. There are significant deviation of the grafts survival among group A, B and C(F=6.821,P 0.05). The survival of transplantation rats were (24.1 6.8)
9、,(51.7 7.9),and(95.2 12.7) days in group A, B, and C, respectively. The survival of transplantation rats compared each other were same as the survival of grafts (F=6.821,P 0.05).(3)In group A, Serum IL-2 and TNF- concentration were elevated to a high level within seven days post-transplantation and
10、significantly increased compared with that pre-transplantation(P0.01). Serum IL-4 and IL-10 concentration were significantly decreased compared with that pre-transplantation(P0.01).(4) Hematoxylin-eosin staining of grafts showed islets bolus under the kidney capsule of transplantation rats, no infla
11、mmatory cell infiltrate and expression of insulin protein at islets in group B and C. The grafts positively stained for CD40LIg in group C. 【Conclusion】 CD40LIg gene modified bone marrow mesenchymal stem cells could prolong the survival time of islet xenografts and inhibit the rejection of islet xen
12、ografts.Key words: islet xenografts; diabetes mellitus; bone marrow mesenchymal stem cells; CD40LIg动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是一种慢性心血管疾病,严重威胁人类健康?尽管动脉粥样硬化是一个多因素参与的复杂病理过程,但血液中的单核细胞迁移至内皮下分化为巨噬细胞后吞噬脂质,特别是氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, ox-LDL),进而形成泡沫细胞仍然是关键环节?巨噬细胞吞噬脂质主要通过细胞膜上的清道受体(scavenger
13、receptors, SRs)完成?其中,A 类清道夫受体(scavenger receptor A,SR-A)和 B型清道夫受体 CD36(cluster of differentiation36,CD36)在巨噬细胞摄取各种修饰型低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)过程中发挥了重要作用1?近年来研究表明,微小 RNA(microRNA) 参与调控了心血管系统的多种功能, 其表达异常与多种心血管疾病的发生和发展密切相关2?MicroRNA-155(miR-155)是一个典型的多功能 microRNA,已有资料表明,miR-155 在免疫反应?炎症?肿瘤发生等
14、过程中发挥了重要的作用3?最近的研究显示 miR-155在巨噬细胞泡沫化过程中表达上调4,但其对巨噬细胞泡沫化和动脉粥样硬化形成的作用尚不清楚?本研究探讨了 miR-155对 THP-1巨噬细胞泡沫化过程的影响及其可能机制,以评估 miR-155是否可作为防治动脉粥样硬化的新靶点?1 材料与方法1.1 试剂与仪器人类单核细胞株 THP-1细胞(中国科学院上海细胞生物学研究所);RPMI1640 细胞培养基?胎牛血清?青/链双抗(GIBCOBRL 公司);佛波酯(PMA)?油红 O?Hoechst33258?蛋白酶抑制剂 cocktail(Sigma公司);SR-A 和 CD36抗体(RD 公司
15、);HRP 标记的驴抗山羊 IgG(Santa Cruz公司);l,l-dioctadecyl-3,3,3,3-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate(DiI)荧光探针(Probe 公司);其余试剂均为进口或国产分析纯产品?CO2 培养箱(美国 Precision公司);SW-CJ-IF 超净工作台(江苏苏净集团苏州安泰空气技术有限公司);pH 计(瑞士 Mettler Toledo公司);倒置显微镜(重庆光学仪器厂);激光扫描共聚焦显微镜(日本 Olympus公司);超速离心机(美国 Beckman公司);酶联免疫仪(美国 MJ RESEARCH公司
16、);小型垂直电泳和电转装置?荧光定量 PCR仪(美国 Bio-Rad公司)?1.2 Ad-miR-155 和 Ad-anti-miR-155腺病毒载体构建腺病毒载体的构建参照文献报道的方法5?Ad-miR-155(5-TCGAGCCCCTATCACGATTAGCA TTAATTCAAGAGATTAATGCTAATCGTGATAGGGGA-3)和 Ad-anti-miR-155(5-CTAGTCCCCTATC ACGATTAGCATTAATCTCTTGAATTAATGCTAATCGTGATAGGGGC-3)的制备按照 AdMax(Microbix)和 pSilencerTM adeno 1.0-
17、CMV (Ambion) systems说明书进行?病毒经 HEK293A细胞进行包装?扩增后,CsCl 纯化,含 100 mL/L甘油的 20 mmol/L Tris缓冲液透析,于-70 保存?腺病毒滴度测定按照Adeno-X Rapid Titer kit (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, USA) 试剂盒说明书进行?实验中以 Ad-LacZ转染组作为对照?1.3 Ox-LDL 和 DiI-oxLDL的制备Ox-LDL 的制备按文献报道的方法6,采用硫酸铜氧化法,简述如下:健康人血浆购自中山大学附属第一医院血液科,采用密度梯度离心的方法,制备
18、 LDL?将 LDL于 4透析 24 h,期间换液 3次?在 37下用终浓度为 5 mol/L 的 CuSO4氧化 24 h?接着分别用含 200 mol/L EDTA和不含EDTA的 PBS 4 下分别透析 24 h和 48 h?用 Bradford法测定蛋白含量?在无菌条件下采用 0.45 m 滤膜过滤除菌,4 避光保存,一周内用完?DiI-oxLDL(1,1-dioctadecyl-3,3,33-tetra-methy-lindocyanide percholorate (DiI)-labeled oxLDL)的制备方法如下7-9,采用密度梯度离心的方法,制备 LDL,用一定量的无脂蛋白
19、血清调节LDL浓度至 1 mg/mL,每毫升 LDL中加入 5 L 浓度为 30 mg/mL的 DiI储存液,37 避光孵育 18 h,使 LDL转变为 Dil-LDL?经密度梯度离心提取DiI-LDL,PBS透析 48 h,期间换液 3次?加入终浓度为 5 mol/L 的CuSO4,37 氧化 24 h,然后分别用含 200 mol/L EDTA和不含 EDTA的PBS分别透析 24?48 h?采用 0.45 m 滤膜过滤除菌,4 避光保存,一周内用完?1.4 细胞培养和实验分组THP-1 细胞株由中国科学院上海细胞生物学研究所提供,用含 100 mL/L小牛血清,1%双抗的 RMPI164
20、0培养基,置于体积分数 5% CO2,37 的细胞培养箱内培养?将细胞按 1106密度接种于 35 mm培养皿中,以100 ng/mL的 PMA刺激 THP-1细胞 48 h后诱导其分化成巨噬细胞?实验分组如下:在观察过表达 miR-155对巨噬细胞的影响时分为 6组:空白对照组?Ad-LacZ 组?ox-LDL+Ad-LacZ 组?ox-LDL+Ad-miR-155(25 MOI)组?ox-LDL+Ad-miR-155(50 MOI)组?ox-LDL+Ad-miR-155(100 MOI)组;在观察抑制 miR-155对巨噬细胞的影响时分为 4组:Ad-LacZ 组?Ad-anti-miR-
21、155(50 MOI)组?ox-LDL+Ad-LacZ 组?ox-LDL+Ad-anti-miR-155(50 MOI)组?1.5 实时定量 PCR检测 ox-LDL对 miR-155表达的影响参照操作手册,用 Trizol法抽提总 RNA?2 g 总 RNA逆转录至终体积为 20 L,采用 SYBR Green实时荧光 PCR方法检测 miR-155的表达?用 miR-155特异性的具有茎环样结构的引物 5-GTCGTATCCAGTGCAGGGTC-CGAGGTATTCGCAC TGGATACGACCCCCTA-3合成互补的 DNA,检测 miR-155的表达?定量多聚酶链反应(qPCR)引
22、物设计,正向引物:5-CTGTTAATGCTAATCGTGAT AG-3;反向引物 5-GCAGGGTCCGAGGT-3?核内小分子 RNA U6作为内参,引物设计如下,正向引物:5-CTCGCTTCGGCAGCACA-3;反向引物:5-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3?PCR反应体系包括:1 L RT逆转录产物,10 L SYBR Green PCR Master Mix和 500 nmol/L正向以及反向引物?反应采用 MyiQ单色实时 PCR检测系统(Bio-Rad),先 95 孵育 30 min,然后进行 40个循环(95 10 s, 60 30 min)?U6 做为内参,
23、采用 2-CT 法分析基因相对表达量?1.6 Western Blot 检测 SR-A 和 CD36蛋白表达情况总蛋白的提取:用冰浴的 PBS洗涤细胞 3遍,加入 RIPA裂解液 100 L,冰上裂解 30 min?刮下并收集细胞 ,4 ,12 000 r/min(r=9.5 cm)离心 10 min,吸取上清液,用 BCA法进行蛋白质定量,-80保存?Western Blot检测 SR-A和 CD36蛋白表达:以 60 g 蛋白每泳道上样,经 8% SDS-PAGE 电泳分离,电转移蛋白至 PVDF膜,5% 脱脂牛奶室温封闭 1 h 后,一抗(SR-A,14 000;CD36,11 000)
24、,4 孵育过夜; TBST 洗涤 3次,每次5 min,二抗(HRP 标记的驴抗山羊 IgG 14 000;12 000),室温孵育 1 h,TBST 洗涤 3次,每次 10 min?ECL化学发光法检测蛋白表达,以 -actin为内参,计算蛋白表达的相对变化?1.7 激光共聚焦显微镜观察 miR-155对巨噬细胞结合?摄取 DiI-oxLDL能力的影响按文献报道的方法进行10,主要步骤简述如下:病毒转染 24 h后,加入 ox-LDL处理细胞 48 h?随后各组分别加入终浓度为 10 g/mL 的 DiI-oxLDL,于 4 下孵育细胞 2 h(反映巨噬细胞结合 DiI-oxLDL能力)或
25、37 下孵育细胞 4 h(反映巨噬细胞摄取 DiI-oxLDL能力),经 40 g/L多聚甲醛固定 10 min后,加入终浓度 5 mg/L的 Hoechst33258避光染色 5 min,PBS洗涤 3次后,激光共聚焦显微镜下(600)观察拍摄?各组随机选取 5个视野,运用 confocal自带 Fluorescence View软件测定视野内所有细胞的细胞内平均荧光强度并计算平均值?1.8 数据分析和统计所有实验结果用均数标准差(x s)表示?采用 SPSS 13.0进行统计学分析,多组资料比较采用方差分析,两两比较采用 t检验,P0.05表示差异有统计学意义?2 结 果2.1 Ox-LD
26、L 诱导巨噬细胞 miR-155表达上调实时定量 PCR结果显示,在 THP-1细胞,80 g/mL 的 ox-LDL可以诱导 miR-155的表达上调?Ox-LDL 作用后 2 h,miR-155表达开始增加,6 h达到最高?尽管 8 h开始有所降低,但 ox-LDL作用后一直到 72 h,miR-155表达仍维持在较高表达水平(图 1)?2.2 过表达 miR-155抑制巨噬细胞结合?摄取 DiI-oxLDL为明确 ox-LDL诱导 miR-155表达上调的功能,我们观察了腺病毒转染 miR-155(Ad-miR-155)后对巨噬细胞结合和摄取 DiI-oxLDL的影响?结果显示,与对照组
27、相比,ox-LDL 处理细胞 48 h后,巨噬细胞摄取 DiI-oxLDL的能力明显增加?Ox-LDL 处理后细胞内的平均荧光强度从对照组的26225增加至 433 29(n=6, P 0.05)?Ad-miR-155转染可明显抑制巨噬细胞摄取 DiI-oxLDL的能力?Ad-miR-155 不同滴度(25 MOI,50 MOI,100 MOI)转染后,细胞内平均荧光强度分别降至 353 22(n=6,P 0.05),285 11(n=5, P 0.01)和 247 12(n=6,P 0.01)?而 Ad-LacZ转染无作用(图 2A)?同时我们观察到,ox-LDL 处理细胞 48 h后,巨噬
28、细胞结合 DiI-oxLDL的能力亦明显增加?Ox-LDL 处理后细胞内的平均荧光强度从对照组的 84 6增加至 221 12(n=6, P 0.05)?Ad-miR-155转染(50 MOI)可明显抑制巨噬细胞与 DiI-oxLDL的结合,Ad-miR-155 转染使细胞内的平均荧光强度降至 146 16(n=6, P 0.01)(图 2B)?2.3 抑制 miR-155促进巨噬细胞结合?摄取 DiI-oxLDL为进一步明确 miR-155对巨噬细胞结合和摄取 DiI-oxLDL的影响?我们研究了腺病毒转染反义-miR-155(Ad-anti-miR-155)的作用?图 3A显示,Ad-an
29、ti-miR-155 转染(50 MOI)后,基础状态和 ox-LDL刺激后的巨噬细胞摄取 DiI-oxLDL的能力均明显增强?Ad-anti-miR-155 作用后,基础状态下,细胞内的平均荧光强度从 Ad-LacZ转染组的 292 26增加至明显增加 402 34(n=5,P 0.05)?Ox-LDL处理后,细胞内平均荧光强度较对照组增加(481 33 vs. 292 26, n=5,P 0.05)?Ad-anti-miR-155转染可进一步增强 oxLDL的作用,使细胞内平均荧光强度增加至559 34(n=5, P 0.05)?另一方面,巨噬细胞结合 DiI-LDL的能力也明显增加?在基
30、础状态下和和 ox-LDL刺激后,Ad-anti-miR155 转染分别使巨噬细胞内的平均荧光强度从 142 7增加至 190 10(n=5,P0.05)以及从 289 13增加至 37224(n=5,P0.05)(图 3B)?2.4过表达 miR-155降低了 SR-A和 CD36的表达由于巨噬细胞摄取脂质主要通过膜上的清道夫受体完成,因此,我们进一步分析了腺病毒转染 miR-155(Ad-miR-155)后对巨噬细胞 SR-A和CD36表达的影响?结果发现,随 Ad-miR-155转染滴度的增加,SR-A 和 CD36的表达逐渐降低?MiR-155 不仅抑制基础状态下 SR-A和 CD36的表达,而且逆转 ox-LDL诱导的 SR-A和 CD36蛋白表达的上调(图 4A,图 4B)?2.5 抑制 miR-155上调 SR-A和 CD36的表达进一步我们观察了抑制 miR-155对巨噬细胞清道夫受体表达的影响?Western Blot 结果显示,与对照组相比,转染 Ad-anti-miR155(50 MOI)可显著增加基础状态下巨噬细胞中 SR-A和 CD36的表达,差异具有统计学意义(n=6,P 0.05)(图 5A)?加入 ox-LDL刺激巨噬细胞后,SR-A 和 CD36的表达上调?预先转染 Ad-anti-miR155 (50 MOI),可进一步增加 SR-A和
