1、CD59 配体肽基因对卵巢癌细胞 CD59 表达的影响作者：李伟伟 高美华 张蓓 解西河【摘要】 目的 研究 CD59 配体肽基因对卵巢癌细胞 CD59 表达的影响。方法 构建 CD59 配体肽基因的真核表达重组体(CD59 配体pIRES), 转染人卵巢癌细胞 A2780,G418 筛选稳定表达细胞克隆;RTPCR 及 Western blot 方法检测细胞表面 CD59 mRNA 及蛋白的表达;MTT 法测定细胞增殖抑制率。结果 成功构建了 CD59 配体肽基因真核表达重组体,转染后的A2780 CD59 mRNA 及蛋白的表达水平与 WTA2780 比较均明显下降(t=9.21、7.20
2、,P0.05);细胞增殖抑制率明显增高(F=5.417,q=3.93,P0.05)。结论 CD59 配体肽基因可影响人卵巢癌细胞 A2780 表面 CD59 的表达,有望用于肿瘤治疗。 【关键词】 抗原,CD59;A2780 细胞;重组融合蛋白质类ABSTRACT Objective To study the influence of CD59 ligandpeptide on ovarian cancer cell CD59. Methods A eukaryotic expression recombinant of ligandpeptide of CD59 was created an
3、d transfected into A2780 cells. Stable expressive cell clone was screened by addition of G418. The level of CD59 mRNA and protein was detected by RTPCR; and cytostasis rate detected by MTT. Results A eukaryotic expression recombinant of ligandpeptide of CD59 was successfully constructed. The express
4、ions of CD59 mRNA and protein in transfected A2780 cells were lower than that of WTA2780 (t=9.21,7.20;P0.05), and cytostasis rate obviously increased (F=5.417,q=3.93,P0.05). Conclusion CD59 Ligandpeptide can influence the expression of CD59 mRNA and protein on the surface of A2780 cells, which is ho
5、pe to be used for oncotherapy.KEY WORDS antigens, CD59; A2780 cells; recombinant fusion proteinsCD59 是一种广泛分布于细胞膜表面的糖基磷脂酰肌醇锚固糖蛋白，具有抑制补体效应的功能。首先，CD59 以同源限制形式抑制新生补体攻膜复合物(MAC)形成，保护自身正常组织细胞免遭补体溶细胞损害1。其次，在多种生殖系统肿瘤细胞中发现 CD59 的过表达，提示 CD59 可能与肿瘤细胞逃脱免疫监视相关。对 CD59 活性位点的研究显示, Trp40 对于 CD59 分子正常发挥生物活性具有重要作用2。本科室
6、利用噬菌体肽库筛选与 CD59 高效结合的短肽，并合成 CD59 配体肽基因。实验结果显示，CD59 配体肽基因可显著增强补体对肿瘤细胞的溶解作用3，说明CD59 配体肽基因可以结合并封闭正常 CD59 分子的补体结合位点，具有中和正常 CD59 分子活性的作用。本研究旨在进一步探讨 CD59 配体肽基因对卵巢癌细胞 CD59 表达的影响。现将结果报告如下。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 质粒、菌株与细胞株 pIRES 真核表达质粒、大肠杆菌DH5 与人卵巢癌细胞 A2780 均由本教研室保存;PMD18Tvector 由大连TaKaRa 公司生产。1.1.2 主要试剂 PCR、RTPC
7、R 所需引物由上海生物工程技术服务有限公司生产;限制性内切酶 EcoR、Nhe、Hind 、T4 DNA ligase及 PCR、RTPCR 检测试剂盒均购自大连 TaKaRa 公司; ECM Kit 由美国Boster 公司生产;Lipofectin Reagen 2000 由美国 Invitrogen 公司生产。1.2 方法1.2.1 基因序列的获得 根据 CD59 配体肽氨基酸序列，得到完整CD59 配体肽基因序列。以其碱基序列为基础，设计 2 条单链，二者互为引物，各含 54 个碱基且于 3端 19 位碱基处反向互补。行搭桥 PCR 获得带酶切位点(EcoR、Nhe)的 CD59 配体
8、肽基因序列4。1.2.2 CD59 配体pIRES 真核表达重组体的构建及鉴定 CD59 配体肽基因的制备:以 A、B 链互为模板引物行 PCR 反应。反应条件：首先 94 预变性 2 min;然后 94 变性 30 s，46 退火 1 min，68 延伸 2 min，5 个循环;最后 68 延伸 5 min。取上述扩增产物 2 L 在 30 g/L的琼脂糖凝胶上进行电泳。 CD59 配体pIRES 真核表达重组体构建及鉴定：spdsDNA 片段回收纯化，与 Tvector 4 过夜连接，连接产物 TSS法转化感受态大肠杆菌 DH5，氨苄青霉素及蓝白斑筛选，随机选取单克隆白斑菌落过夜摇菌，小提
9、质粒。质粒分别行 PCR、Nhe单酶切、DNA测序法鉴定 CD59 配体pIRES18T 阳性重组子。CD59 配体pIRES18T 阳性重组子质粒行 EcoR、Nhe双酶切，回收纯化外源基因片段。pIRES 真核表达质粒的获得与纯化与外源基因片段获得方法相同。外源基因片段与载体的连接、连接产物的转化、阳性重组子质粒 PCR及 DNA 测序鉴定方法同 sp18T 重组克隆载体。质粒 EcoR、Nhe双酶切后，取酶切产物 5 L 在 15 g/L 的琼脂糖凝胶上电泳。1.2.3 人卵巢癌细胞 A2780 的转染及稳定转染细胞系的建立 参照分子克隆实验指南(第 3 版)中的方法进行转染,G418
10、压力筛选建立稳定转染细胞系。CD59 配体pIRES 重组质粒转染细胞命名为 CD59 配体A2780, pIRES 空质粒转染细胞命名为 WTA2780 。1.2.4 RTPCR 方法检测转染细胞 CD59 配体肽基因 mRNA 的表达 采用 BIOZOL 总 RNA 提取试剂分别提取 CD59 配体A2780 和 WTA2780总 RNA。鉴定 CD59 配体肽基因表达所用的上游引物为5CATGTCATTGGCCTTGGTGT3 ，下游引物为5ACATTGGGTGCATTGGTAGA3 。RTPCR 采用两步法，首先以总 RNA为模板。42 反转录反应 45 min;然后以反转录液为模板
11、, 反应条件：94 预变性 3 min;然后 94 变性 30 s，49 退火 50 s，68 延伸 1 min，共 30 个循环;最后 72 延伸 5 min。取扩增产物 5 L 在 30 g/L琼脂糖凝胶上电泳。1.2.5 RTPCR 检测转染细胞 CD59 mRNA 的表达 采用 BIOZOL 总RNA 提取试剂盒分别提取 CD59 配体A2780 和 WTA2780 总 RNA。鉴定CD59 表达的上游引物为 5CTGCCATTCAGGTCATAGCC3 ，下游引物为 5GAGAAATGGAGTCACCAGCA3 。鉴定内参照 GAPDH 表达的上游引物为 5CGTGGAAGGACTC
12、ATGACCA3, 下游引物为5TCCAGGGGTCTTACTCCTTG3 。 CD59 cDNA PCR 反应条件：94 预变性 3 min;然后 94 变性 30 s，47 退火 52 s，68 延伸 1 min，32 个循环;最后 70延伸 5 min。GAPDH cDNA PCR 反应条件：94 预变性 3 min;然后 94 变性 30 s，45 退火 1 min，68 延伸 1 min，25 个循环;最后 68 延伸 5 min。取扩增产物 CD59 7 L 及GAPDH 2 L 在 30 g/L 琼脂糖凝胶上电泳。1.2.6 Western blot 方法检测转染细胞 CD59
13、蛋白的表达 取等量蛋白质在 150 g/L 的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，电泳后聚丙烯酰胺凝胶电转印至硝基纤维素膜上，4 过夜封闭;加入 CD59 mAb 10 mL(1400), 37 孵育 1 h 后洗膜; 加入辣根过氧化物酶标记羊抗鼠 IgM 10 mL (14 000)，37 孵育 1 h 后洗膜;加入化学发光显色剂 ECM 显色,暗室条件下X 线片感光 1 min，显影。用 Band Scan 分析软件行条带灰度扫描，求其百分比数值后进行统计学分析。1.2.7 兔抗人 A2780 细胞抗血清的制备 A2780 细胞用含体积分数0.10 小牛血清的 RPMI 1640 培养液培养至细胞生长状
14、态良好。用 2.5 g/L 的胰酶消化成单细胞悬液，PBS 洗 3 次，调整细胞密度至 21011/ L，免疫家兔。免疫结束 10 d 后，心脏采血并自然沉淀分离血清(抗体效价为 15 120)。1.2.8 MTT 法检测细胞增殖抑制率 分别收集 CD59 配体A2780 、WTA2780 及正常 A2780 细胞，RPMI 1640 基础培养液调整细胞密度至 2108/L，置于 96 孔培养板中，每孔 50 L。每标本设 6 个复孔。每孔加兔抗人 A2780 细胞抗血清及含体积分数 0.08 新鲜人血清各10 L, 37 孵育 1 h，每孔加浓度为 5 g/L 的 MTT 10 L,37 孵
15、育4 h，弃上清后加入 100 L DMSO，轻轻吹打混匀后置摇床上 50 r/min震荡溶解 15 min。于波长 630 nm 处测各孔吸光度(A)值并计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=1-(实验组 A-阴性对照组 A)/(阳性对照组 A-阴性对照组 A)100%。重复 3 次取其平均值。1.2.9 统计学处理 利用 SSPS 15.0 及 PPMS1.55统计软件包进行统计学分析。2 结 果2.1 CD59 配体pIRES 真核表达重组体 PCR 及酶切鉴定CD59 配体pIRES 真核表达重组体进行质粒 PCR，电泳后可见长63 bp 清晰条带(图 1)，CD59 配体pIRES 真
16、核表达重组体行质粒EcoR、Nhe双酶切，电泳可见长 78 bp 清晰条带(图 2)，证实 CD59配体pIRES 真核表达重组体构建成功2.3 RTPCR 检测 CD59 配体肽基因 mRNA 表达CD59 配体A2780 的 PCR 产物电泳后可见长约 63 bp 清晰条带(图3)，证实 CD59 配体肽真核表达重组体成功转染 A2780 细胞。2.4 RTPCR 检测 CD59 mRNA 的表达 CD59 配体A2780 及WTA2780 产物电泳后均可见长约 304 bp 清晰条带，其 GAPDH 可见长约509 bp 清晰条带(图 4)。CD59 配体A2780 细胞组灰度百分值为(
17、19.6997.253)，WTA2780 细胞组灰度百分值为(9.8576.882)，两组比较差异有显著意义(t=9.21，P0.05)。2.5 Western blot 方法检测转染细胞 CD59 蛋白的水平CD59 配体A2780 细胞组、WTA2780 细胞组灰度百分值分别为2.8730.545、1.5800.440，两组比较差异有显著性(t=7.20，P0.05)。2.6 锥虫蓝染色测定补体溶细胞功能CD59 配体A2780 细胞组、WTA2780 细胞组及正常 A2780 细胞组细胞增殖抑制率分别为31.6853.427、25.7322.947、26.0194.126，CD59 配体
18、A2780 细胞组细胞增殖抑制率与其他组比较，差异均有显著性(F=5.417,q=4.13、3.93，P0.05)。3 讨 论补体调节蛋白 CD59 的过表达是肿瘤细胞逃避补体溶细胞作用的重要机制6。CD59 是一种多功能的分子, 其主要作用是与 MAC 中的 C8 和(或)C9 结合从而抑制补体的活化。许多研究显示，肿瘤细胞中 CD59 的表达主要有以下特点。肿瘤细胞可以诱导血管内皮生长因子的分泌, 从而诱导肿瘤细胞表面上调 CD59 的表达, 增加周围基质中 CD59 的沉积。在某些肿瘤中一些急性炎症因子，如肿瘤坏死因子 、白细胞介素1、白细胞介素 6 在肝癌中能上调 CD59 的表达7。
19、表达 CD59 的肿瘤细胞自身可以向周围基质释放一些含有锚结构可溶性的 CD59，可以插入到同源细胞的胞膜上，具有补体限制作用，在肿瘤微环境中可以阻止补体及抗体等对肿瘤细胞的结合8。对肿瘤免疫的研究发现, CRP 在肿瘤逃避免疫攻击中起了非常重要的作用，CD59 在多种泌尿系统常见恶性肿瘤及女性生殖系统恶性肿瘤均有高表达，提示与肿瘤逃逸相关。MURRAY 等1用免疫组织化学等方法对54 例良恶性子宫内膜组织中 CRP 的表达进行检测，发现恶性子宫内膜组织高表达 CD59，并推测这是恶性子宫内膜组织之所以能逃避补体攻击所致细胞溶解的原因，并由此间接促进其致癌作用。卵巢癌的发生发展与 CD59 密
20、切相关，CD59 分子的过量表达可直接导致癌细胞逃逸机体的免疫监视。因此，肿瘤免疫治疗方法是使肿瘤细胞膜上的 CD59 失活或不表达，如封闭细胞膜上的 CD59 活性位点已取得了较好的治疗效果。在前期的研究中，本室采用噬菌体展示技术，筛选并合成能与人CD59 分子特异结合的短肽,证实该短肽能与正常的 CD59 分子结合而封闭其活性位点，显著增强补体对高表达 CD59 分子肿瘤细胞的溶破效应，具有中和正常 CD59 分子活性的作用。以此为基点，我们构建 CD59 配体pIRES 真核表达重组体并转染高表达 CD59 的卵巢癌 A2780 细胞，筛选稳定转染克隆细胞系，进行相关功能检测。证实 CD
21、59 配体肽可结合并封闭其补体活性位点，中和其补体抑制活性。但 CD59 配体肽基因重组后，如何影响 CD59 mRNA 的表达，分子在胞内的组装、折叠以及向胞膜的转运模式等机制尚在探讨之中。本研究为前列腺癌的基因靶向治疗开辟了一条新途径，具有重要理论意义及临床应用价值。【参考文献】1MURRAY K P, MATHURE S, KAUL R, et al. Expression of complement regulatory proteinsCD35,CD46,CD55 and CD59in benign and malignant endometrial tissue J. Gyneco
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