1、DcR3 对人肺成纤维细胞合成型胶原的作用作者：杨洋, 乔俊华, 安继红, 张越, 吴春风, 郏博, 马忠森【摘要】 目的: 探讨诱骗受体 3（DcR3）对人肺成纤维细胞（HLF）合成型胶原的作用。方法: OverPCR 方法构建 DcR3 的真核表达载体, 脂质体法转染 HLF 细胞, Western blot 检测 HLF 细胞合成型胶原的含量。结果: 成功构建了 pvax1DcR3 真核表达载体并转染 HLF 细胞; 转染组细胞 Col 表达量明显升高 , 从 12 h 开始持续到 72 h, 与对照组比较差异有统计学意义（P0.01）; 而转染+抗体组与对照组比较差异无统计学意义（P0
2、.05）; 转染组不同时间 Col 表达量有统计学意义（F=34.25, P0.05） 。结论: DcR3 促进 HLF 细胞合成型胶原的能力, 可能是加速肺纤维形成的因素之一。 【关键词】 DcR3 基因; HLF; 型胶原诱骗受体 3 (decoy receptor 3, DcR3)是一个新发现的具有免疫抑制作用的分子, 与多种自身免疫性疾病、 肿瘤、 弥漫性肺间质疾病等相关 1, 2 。有文献报道 DcR3 在肺纤维化患者外周血单核细胞中高度表达3, 但是 DcR3 在肺纤维化的发病过程中, 到底扮演怎样的角色, 目前尚不明确。本研究拟通过检测分析转染 DcR3 后, 肺成纤维细胞合成型
3、胶原的能力, 探讨 DcR3 对肺纤维化形成的作用。1 材料和方法1.1 材料 人肺成纤维细胞（ human lung fibroblast, HLF）购自上海细胞研究所。真核表达质粒 pvax1 购自天根公司; 原核表达质粒 pET28a（+）DCR3 （含酶切位点 BamH I 和 EcoR I）, 为本室构建并保存。Mouse anti human DcR3 自备。小鼠抗人 Col 单克隆抗体(mAb)和相应二抗及 DAB 显色液购自武汉博士德生物试剂公司。PCR 引物、 Primer STARTM HS DNA Polymerase、 DH5E.coli 感受态细胞、 DNA 连接酶、
4、 限制性内切酶 BamH I 和 EcoR I、 核酸分子质量标准、 购自天根公司; LipofectamineTM2000 脂质体、 细胞培养试剂购自Invitregen 公司; 质粒抽提试剂盒购自美国 Promega 公司; PVDF 膜购自 Roche 公司, RPMI1640 培养基细胞培养试剂购自 Sigma 公司。1.2 方法1.2.1 引物设计与合成 参考 GenBank 收录的 DcR3 序列和信号肽序列（AF104419）, 设计引物如下: A1: 5CGGATCCAGCATGGCCCTGTGGATGCGCC3 （斜体为 BamH I 酶切位点）; A2: 5CAGGGGTA
5、GGTGGGTGTTTCTGCCACGGCTGCGGCTGGGTCAGGTC3; B1: 5GACCTGACCCAGCCGCAGCCGTGGCAGAAACACCCACCTACCCCTG3; B2: 5CCGAATTCTCAGTGCACAGGGAGGAAGCG3 （斜体为 EcoR I 酶切位点）上述引物由上海生工生物工程公司合成并纯化。1.2.2 PCR 扩增人 DcR3cDNA 通过 overlap PCR 方法将信号肽和目的基因相连, 扩增出完整的 DcR3cDNA。具体如下: 以含信号肽质粒为模板, 以 A1、 A2 为引物扩增信号肽序列; 以含目的基因质粒为模板, 以 B1、 B2 为
6、引物扩增目的基因; 以 1 和 2 步骤中产物为模板, 以 A1 和B2 为引物扩增即得到含信号肽的目的基因序列。循环条件为: 94 45 s, 63 90 s, 72 1 min, 共进行 35 个循环, 最后一个循环72延伸 10 min。1.2.3 DcR3 重组质粒的构建和鉴定 TaKaRa 胶回收试剂盒回收PCR 产物。提取质粒载体 pvax1, 然后用 BamH I 和 EcoR I 对质粒和纯化后的 PCR 产物分别进行双酶切。酶切产物用 TaKaRa 胶回收试剂盒回收, 紫外分光光度计上测定载体和 PCR 两种双酶切产物量。然后按 101 (DcR3pvax1)的摩尔比混合,
7、16连接反应过夜。将连接产物转化感受态 DH5, 氨苄平板筛选。取阳性单克隆进行扩增, 抽提重组pvax1DcR3 质粒进行 BamH I 和 EcoR I 双酶切 , 然后在 20 g/L 琼脂糖凝胶上电泳鉴定目的片段是否插入。鉴定正确的克隆送上海生工生物公司测序。1.2.4 HLF 细胞培养 HLF 细胞培养采用 100 mL/L FCS 培养液和条件培养液联合培养（11） 。条件培养液制备: 取 5 只 2 周龄博莱霉素法制备的大鼠肺纤维化模型, 用 9 mL/L 生理盐水灌洗肺脏 (1.5 mL/次4 次) , 收集灌洗液, 1 000 r/min 离心 10 min, 弃上清, 将沉
8、淀细胞用含 100 mL/L FCS 的 RPMI1640 培养液于 50 mL/L CO2 培养箱 37培养 2 h , 使巨噬细胞贴壁。改用含 2 mL/L FCS 的培养液(5 mL/瓶) 继续培养 24 h, 收集上清作为条件培养液4 。1.2.5 pvax1DcR3 转染 HLF 细胞 采用 LipofectamineTM2000脂质体转染, 将质粒 4 g/孔用 500 L 无双抗、 无血清的 RPMI1640培养液稀释; 将 10 L 脂质体用 500 L 无双抗、 无血清的 RPMI1640培养液稀释, 静置 5 min; 混合 DNA 和脂质体, 室温放置 20 min; 细
9、胞用 1PBS 洗 2 遍, 加 400 L 无双抗、 无血清 RPMI1640 培养液; 将DNA 和脂质体混合物逐滴加至细胞上, 轻轻摇匀, 37孵育; 4 h 后换成含联合培养基继续培养。细胞分组: 转染组、 对照组、 转染抗体组。1.2.6 Col 胶原检测(Western blot) 细胞转染处理后, 于12、 24、 48、 72 h 收集细胞, 提取细胞总蛋白 , 制备 75 g/L 分离胶进行电泳, 每孔加蛋白 20 g , 上样总体积 20 L, PVDF 转膜, 100 g/L 脱脂奶粉封闭 3 h , 加入小鼠抗人 Col mAb(1500 稀释) , 同时做 actin
10、 内参照; 4摇床过夜; 加入生物素标记的二抗(14 000) , 摇床常温孵育 1 h , X 光底片曝光, 显影及定影, 对电泳条带扫描及图像分析, 得出条带的平均吸光度(A) 。试验重复 3 次。1.2.7 统计学分析 数据以 xs 表示, 采用 SPSS13.0 统计软件, 包括单因素方差分析和多组间两两比较的 LSD 检验。2 结果2.1 重组质粒 pcDNA3.1(+)DcR3 的双酶切鉴定 20 g/L 的琼脂糖凝胶电泳结果显示, 重组质粒 pvax1DcR3 经 BamH I 和 EcoR I 双酶切, 可切出 2 个片段, 大片段迁移率与空质粒双酶切后的片段一致, 约为 2
11、972 bp; 小片段迁移率与设计片段一致, 约为 901 bp(图 1)。图 1 pvax1DcR3 酶切鉴定结果M: DL 2 000 DNA marker; 1, 3: 质粒 pET28a（+）DcR3; 2, 4: 经 BamH I 和 EcoR I 双酶切 pvax1DcR3.2.2 pcDNA3.1(+)DcR3 重组载体测序及序列分析结果 DNA 测序结果显示, 重组质粒含有 901 bp 的目的基因片段, 读码框架正确, 无碱基错配及移码突变。2.3 DcR3 对 HLF 合成 Col 的促进作用 经 Western blot 检测(图 2)和图像分析(电泳分离条带的平均吸光度
12、 A 值) 证明, DcR3 转染人肺成纤维细胞后, 转染组细胞 Col 表达量明显升高, 从 12 h 开始持续到 72 h, 与对照组比较差异有统计学意义（P0.01）; 而转染组+抗体组与对照组比较差异无统计学意义; 转染组不同时间 Col 表达量有统计学意义（F=34.25, P0.05, 表 1） 。说明 DcR3 的表达增强了 HLF 合成胶原的能力。3 讨论弥漫性间质性肺疾病（ILD）是肺内弥漫性成纤维细胞过度增生和细胞外基质过度沉积的一组疾病, 虽然引起 ILD 病因不同, 但其发病都从肺泡炎开始, 最终发展为肺间质纤维化。目前认为 ILD 发病的主要过程如下: 在不同病因作用
13、下肺泡上皮和血管内皮及血液蛋白成分露出, 形成肺泡炎的初始阶段; 病变进一步发展使炎症细胞、 免疫效应细胞进入肺内并释放介质; 在前述细胞及释放介质的作用下, 成纤维细胞活化、增殖及生成胶原和细胞外基质。肺内成纤维细胞活化的结果就是合成、 型胶原的能力增强, 胶原的沉积导致呼吸膜增厚直至取代肺泡组织5 。用博莱霉素制备的 2 周大鼠肺纤维化模型恰好是肺泡炎阶段, 我们利用这个阶段的大鼠肺泡灌洗液制备条件培养液, 就是为了模拟 ILD发病的主要过程, 这样我们的结果更能具有指导临床的作用。前期工作中我们通过亚克隆的方法构建了重组原核表达质粒 pET228a (+)/DcR3, 表达了 DcR3
14、蛋白并制备了 mAb6 。但是, 该质粒中 DcR3 序列（825 bp）不含信号肽, 为了在 HLF 中表达这个基因, 我们用 overPCR 方法把信号肽连接到 DcR3 序列（825 bp）上, 构建了 DcR3 的真核表达载体pvax1DcR3 。 pvax1DcR3 转染 HLF 后 Col 表达量明显升高, 从 12 h 开始持续到 72 h, 与对照组比较差异有统计学意义（P0.01）; 而加入 DcR3 抗体后, 合成 Col 表达量就无明显变化, 与对照组比较差异无统计学意义; 说明就是 DcR3 增强了 HLF 合成胶原的能力, 促进了肺内成纤维细胞活化, 导致胶原沉积在呼
15、吸膜, 加速了肺纤维化的形成。以此作为突破点, 近一步开发可用于临床的 DcR3 抗体, 也许可以成为将来肺纤维化治疗的新途径。【参考文献】1 You RI, Chang YC, Chen PM, et al. Apoptosis of dendritic cells induced by decoy receptor 3 (DcR3)J. Blood, 2007, 15(9): 2413-2418.2 Ka SM, Sytwu HK, Chang DM, et al. Decoy receptor 3 ameliorates an autoimmune crescentic glomerul
16、onephritis model in miceJ. J Am Soc Nephrol, 2007, 18(9): 2473-2485.3 黄志卫, 马忠森, 王秀丽, 等. 外周血单核细胞 DcR3 基因过度表达在间质性肺疾病发病中的意义J. 中华结核和呼吸杂志, 2003, 26(5): 318-319.4 Hirohisa K, Munetaka N , Ichiro W. Effects of acute ethanol administration on LPS induced expression of cyclooxygenase2 and inducible nitric ox
17、ide synthase in rat alveolar macrophagesJ. Alcohol Clin Exp Res, 2005, 29(12): 285-293.5 Gaenko GP, Khaidukov SV, Molotkovskii YG. Expression of type collagen by Lewis pulmonary carcinoma cellsJ. Bull Exp Biol Med, 2004, 137(4): 67-69.6 吴春风, 马忠森, 王秀丽, 等. 人 DcR3 融合蛋白的表达、 纯化及多克隆抗体的制备J. 细胞与分子免疫学杂志, 2007, 23 (12) 1160-1162.
