1、D1 和 CDK4 在口腔正常上皮、炎症及鳞癌中表达的定量分析作者：马妍 金岩 孙庆妹 李媛 Tipoe GL 【关键词】 ,细胞周期蛋白类 关键词: 细胞周期蛋白类;周期蛋白依赖激酶;上皮癌 摘 要:目的 通过检测口腔粘膜的正常上皮、非特异性炎症上皮及鳞癌中 cyclin D1 与 CDK4 的表达，探讨其在上皮组织不同状态中的变化及意义. 方法 用临床病理标本，设立对照，选择 cyclin D1 和 CDK4 抗体免疫组化染色. 结果 cy-clin D1 和 CDK4 在正常口腔上皮与口腔鳞癌上皮、非特异性炎症与口腔鳞癌上皮中的表达间有统计学差别（P0.05） ，正常组与炎症组间无差别，
2、cyclin D1 及 CDK4 在口腔鳞癌上皮中过表达（P0.05）. 结论 cyclin D1 与 CDK4 过表达的机制可能由于基因扩增或其他因素使其蓄积，口腔鳞癌组分级间的差异性提示其可作为肿瘤分级的评价指标之一. Keywords:cyclins;cyclin dependent kinases;epithlium ma-lignant Abstract:AIM To evaluate the expression and significance of cyclinD1/CDK4in normal epithelia（N） ，inflammatory（IF）and squamous
3、 cell cacinoma（SCC）of cheek mucosa.METHODS Oringinal pathology specimens were collected cut and immunostained by cyclin D1monoclonal antibody andCDK4polyclonal antibody，using the avidin-biotin peroxidase complex technique（ABC）.RESULTS There was statistical significance between the N group and SCC gr
4、oup，but not be-tween the N group and IF group.Cyclin D1and CDK4were overexpressed in SCC.CONCLUSION Overexpression of cyclinD1and CDK4in SCC may be due to the gene amplifica-tion and/or other related factors.The variations of cyclin D1and CDK4in different subgroups of SCC may be a helpful indicator
5、for tumor grading. 0 引言 细胞周期蛋白 D（cyclin Ds）及蛋白依赖激酶（CDKs）在调节细胞增殖周期中的作用已有大量研究报道1，2 ，其作为细胞分裂周期的起始点 G1-S 期的正性调节因子，使细胞分裂加速，在肿瘤的发生机制中具有重要意义，因此，我们拟对 cyclin D1 和 CDK4 在口腔颊部粘膜正常组（N） 、炎症组（IF） 、鳞癌组（SCC）中的表达进行免疫组化的定量研究，分析 cyclin D1 及 CDK4 在 N，IF，SCC3 组及不同鳞癌分级中的变化及意义. 1 材料和方法 1.1 标本制备 选用本科收集的标本，包括 10 例正常粘膜上皮（N组）
6、 、10 例慢性非特异性炎症（IF 组）和颊部鳞癌 22 例（SCC 组） ，SCC组包括转移及复发的 10 例，并依据细胞分化程度、角化程度及核分裂为指标，按 WHO 标准将 SCC 组标本分为，级（级 8 例，级 9例，级 5 例） ，所有标本均为 100mLL-1 福尔马林固定，石蜡包埋，切片. 1.2 免疫组化染色 切片厚度为 5m，经梯度乙醇脱蜡至水，1gL-1 胰酶消化，30mLL-1 双氧水阻断内源性过氧化物酶，正常血清封闭 37，30min，分别加 cyclin D1 单抗和 CDK4 羊抗（购自 Santa Cruz 公司）一抗，滴加于切片上，4过夜，次日晨滴加生物素化的二抗
7、和复合物（LSAB 试剂盒购自 DAKO 公司） ，37恒温箱中各 30min，各步骤均用 PBS 充分振洗，DAB 显色，常规脱水、透明、树脂封片.染色过程中，严格控制显色时间和温度，3 组在同一时间、同一条件下、同批处理. 1.3 cyclin D1/CDK4 阳性细胞表达及定量 cyclin D1 与 CDK4 在细胞中的阳性信号均为覆盖胞质、胞核的棕黄色颗粒，用免疫组化定量测量系统，对 3 组进行测量.每次测量前，都以同一空白片作标准，调整系统光度至设定的标准灰度.在同一灰度条件下，对 3 组标本上皮的基底层和棘细胞层进行自动测量，避开上皮的角化层和鳞癌癌巢中心的角化区.每张片子选择
8、5 个不同的视野，用鼠标按照上皮的形态画出测量区，自动测量，选平均灰度为测量指标.系统设定白色最大灰度为 256，黑色最小灰度为 0，灰度值越小，说明其阳性反应程度越高. 统计学处理:用统计分析软件进行显著性方差分析（ANOVA）比较分组间的差别，Spearman 和 Pearson 相关分析 SCC 组的分级与 cyclin D1和 CDK4，以及 cyclin D1 与 CDK4 的相关性. 2 结果 2.1 cyclin D1 和 CDK4 免疫组化结果 在 3 组中 cyclin D1 与 CDK4均有阳性反应，N 组呈弱阳性，主要集中在棘细胞层，反应强度基本一致，IF 组中反应强度不
9、一，部分细胞阳性反应较强，也以棘细胞层染色为主，两组角化层均呈阴性反应.SCC 组中 cyclin D1 阳性表达很强（Fig1） ，为强阳性反应，不同细胞分化的组织中阳性表达也存在较大差异，中度分化和低分化鳞癌以及有转移、复发的病例阳性表达程度最高.CDK4 在 3 组中的阳性表达结果与 cyclin D1 相似，N 组和 IF 组中的表达较弱，主要分布在上皮的棘细胞层，以覆盖胞核、胞质的棕黄色颗粒为阳性信号，鳞癌组的组织细胞增生活跃，CDK4 阳性表达很强（Fig2） ，不同细胞分化的组织间阳性表达也存在差异.定量结果见 Tab1，2. 图 1 图 2 略 表 1 各组间 cyclin D
10、1 和 CDK4 阳性反应的定量结果 略 2.2 统计分析结果 ANOVA 统计结果表明，在平均灰度水平上cyclin D1 和 CDK4 的表达在 SCC 组与 N，IF 组间均有显著性差异（P0.05）;cyclin D1 与 CDK4 在 SCC，SCC和 SCC间也有显著性差异（P0.05）.相关性分析表明 cyclin D1 与 CDK4 的表达间有显著的正相关关系（r=0.4684，P=0.0052）;CDK4 平均灰度与鳞癌分级之间呈负相关趋势（r=-0.3152，P=0.0702）. 表 2 cyclin D1 和 CDK4 在 SCC 分级间的平均灰度定量结果 略 3 讨论
11、正常细胞的生长、代谢具有一定的顺序和周期性，细胞分裂的调控对于多细胞生物是至关重要的.目前认为细胞周期蛋白通过 cyclin-CDK-CKI 的网络调控实现对细胞周期的调节.细胞周期中有两个关键的节点（check point）控制着细胞能否进入下一个分裂时相，一个是 G1-S 期（也被称为起始点） ，一个位于 G2-M 期，其中与 G1-S 期联系最紧密的是cyclin Ds 与 CDK4/CDK6，细胞周期蛋白 D 的分子质量为 3334ku，分为3 个亚类 D1，D2 和 D3，又分别位于人 11q13，12q13 和 6q21 上的 Bcl-1，CL-ND2/Vin-1 和 CLND3
12、基因编码3 ，cyclin D 作为细胞周期的正性调控因子，使细胞由 G1 期越过 S 期，这种作用尤以 cyclinD1 为代表，cyclin D1 在 G1 期的这种正性调控作用是通过 cyclin D1 与细胞周期蛋白依赖激酶 CDK4/CDK6 结合并使之激活，活化的 CDK4/CDK6 又使pRb（视网膜母细胞瘤蛋白）在 G1-S 转换期发生磷酸化，从而使 E2F 从pRb 抑制下解离，进一步激活这些基因的表达、启动 DNA 复制，推动细胞从 G1 期进入 S 期4 . 肿瘤细胞区别于正常细胞的基本特征是细胞生长失控和分化受阻，其内在的原因则是由于 DNA 的结构与功能的改变，包括基
13、因的点突变，缺失，截断及扩增等，正常情况下，cyclin D1 在 G1 期是恒定的，其过量表达可导致 G1 缩短，细胞分裂速度加快，近年来许多研究工作证实，cyclin D1 为原癌基因，在多数肿瘤如:肝细胞癌、胃肠癌、子宫内膜癌、肺癌中都发现有 cyclin D1 的过量表达，用免疫组化法对乳腺癌 cyclin D1 表达的阳性检出率比在基因基础上分析检出的阳性率要高，人们得出，其过表达的机制除了由于基因扩增，还可能存在使 cyclin D1 蓄积的其他不明机制5-8 ，另外对周期蛋白 D1 过表达的成瘤性也有了试验依据9，10 ，同时还有学者提出 cyclin D1 基因的过表达与肿瘤分
14、级和预后相关11 ，但也有人提出异议，认为 cyclin D1 过表达与长期生存率无明显相关性 12 . 我们的结果显示，cyclin D1 与 CDK4 在口腔颊部鳞癌中有强阳性表达，而且它们的表达具有协同性的特点.这些结果说明肿瘤细胞的增殖旺盛，与其生长失控的特点吻合，作为对照的正常组和非特异性炎症组中的细胞处于正常的细胞增殖状态，其表达 cy-clin D1 与 CDK4 的水平明显低于鳞癌组，而且 cyclinD1 作为 cyclin-CDK4-CDI 网络的正性调控亚基，在 鳞癌细胞中与 CDK4 均有强阳性表达，这一结果可能在口腔粘膜的癌变机制中占有重要的地位，它们的基因扩增或突变
15、，导致其表达产物的质和量的改变，从而引起细胞增殖分裂加速，进入一种失控的无限增殖状态.结果同时显示 CDK4 与鳞癌分级有相关趋势，虽样本量较小，但结果仍可提示 CDK4 可作为肿瘤患者病理分级或作为预后评价的辅助指标之一. 研究结果表明，口腔颊部粘膜不同性质的病损中 cyclin D1 与 CDK4的表达有明显的趋势性，即在鳞癌组阳性反应程度最高;而且分化不同的鳞癌中又以级鳞癌组的阳性水平最高;同时 cyclin D1 与 CDK4 的表达具有协同性的特点从一个侧面揭示了口腔粘膜上皮癌变中 cyclins 及CDKs 在细胞增殖周期及口腔粘膜癌变中的作用. 参考文献: 1Zavitz KH，
16、Zipursky SL.Controlling cell proliferation in differ-entiating tissues:Genetic analysis of negative regulators of G1S-phase progression J.Curr Opin Cell Biol，1997;9（6）:773-781. 2Garrett MD，Fattaey A.CDK inhibition and cancer therapy J.Curr Opin Genet Dev，1999;9（1）:104-111. 3Xiong Y，Menninger J，Beach
17、 D，Ward DC.Molecular cloning and chromosomal mapping of CCND genes encoding human D-type cyclins J.Genomics，1992;13:575-584. 4Mate JL，Ariza A，Aracil C，Lopez D，Isamat M，Perez-Piteira J，Navas-Palacios JJ.Cyclin D1overexpression in non-small cell lung carcinoma:Correlation with Ki67labbelling index and
18、 poor cytoplasmic differentiation J.J Pathol，1996;180（4）:841-854. 5Sherr CJ.Cancer cell cycle J.Science，1996;274（5293）:1672-1677. 6Bartkova J，Lukas J，Muller H，Lutzhoft D，Strauss M，Bartek J.Cyclin D1protein expression and function in human breast cancer J.Int J Cancer，1994;57（3）:353-361. 7Jiang W，Kah
19、n SM，Tomita N，Zhang YJ，Lu SH，Weinstein IB.Amplification and expression of the human cyclin D gene in esophageal cancer J.Cancer Res，1992;52（10）:2980-2983. 8Gillett C，Fantl V，Smith R，Fisher C，Bartek J，Dickson C，Barnes D，Peters G.Amplification and overexpression cyclin D1in breast cancer dedected by i
20、mmunohistochemical staining J.Cancer Res，1994;54（7）:1812-1817. 9Zhou P，Jiang W，Zhang YJ，Kahn SM，Schieren I，Santella RM，Weinstein IB.Antisense to cyclin D1inhibits growth and reverses the transformed phenotype of human esophageal cancer cells J.Oncogene，1995;11（3）:571-580. 10Arber N，Doki Y，Han EK，Sga
21、mbato A，Zhou P，Kim NH，Delohery T，Klein MG，Holt PR，Weinstein IB.Antisense to cyclin D1inhibits the growth and tumorigenicity of human colon cancer cells J.Cancer Res，1997;57（8）:1569-1574. 11Jares P，Fernandez PL，Campo E，Nadal A，Bosch F，Aiza G，Nayach I，Traserra J，Cardesa A.PRAD-1/cyclin D1gene am-plifi
22、cation correlates with messenger RNA overexpression and tumor progression in human laryngeal carcinomas J.Cancer Res，1994;54（17）:4813-4817. 12Adelaide J，Monges G，Derderian C，Seitz JF，Birnbaum D.Oe-sophageal cancer and amplification of the human cyclin D gene CCND1/PRAD1J.Br J Cancer，1995;71（1）:64-68.
