1、DIM 联合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对前列腺癌细胞的抑制作用作者：匡幼林 翁小东 陈志远 刘修恒 祝恒成 江波涛【摘要】 目的 探讨 3,3 二吲哚基甲烷（DIM）联合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）对前列腺癌细胞的抑制作用。方法 CCK8 法测定 DIM、TRAIL 及 DIM联合 TRAIL作用于 PC3 细胞后的细胞生存率，同时用流式细胞术测定细胞凋亡率，Western 印迹检测caspase3 表达水平的变化。结果 各给药组与对照组比较均能不同程度抑制 PC3 细胞增殖并诱导其凋亡，且 caspase3 表达上调；DIM 与TRAIL联用明显增强诱导凋亡作用。结论 DIM
2、与 TRAIL联用均可明显增强 PC3 细胞抑制效果和诱导凋亡作用，其凋亡作用机制可能与其上调caspase3 表达有关。 【关键词】 前列腺癌；肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体；3,3 二吲哚基甲烷；细胞凋亡【Abstract】 Objective To investigate the inhibitory effect of 3, 3diindolylmethane (DIM) in combination with TNFrelated apoptosisinducing ligand (TRAIL) on the prostate cancer cells. Methods CCK8 me
3、thods was used for detecting the survival rate of PC3 cells treated with DIM, TRAIL, or DIMTRAIL. The apoptosis rate of PC3 cells was tested by flow cytometry (FCM). The expression of caspase3 was measured by Western blot. Results Compared with that of control group, the proliferation of PC3 cells w
4、as inhibited and the apoptosis was induced differently in all treatment groups, and the expression of caspase3 was upregulated. The combined use of DIMTRAIL induced apoptosis of PC3 cells. Conclusions Combination use of DIM and TRAIL could obviously enhance the inhibitory effects and apoptosis rate
5、on PC3 cells. The possible mechanism may be the upregulation of expression of caspase3.【Key words】 Prostate cancer; TNFrelated apoptosisinducing ligand; 3, 3diindolylmethane; Apoptosis前列腺癌是一种发生于老年男性的常见肿瘤。肿瘤坏死因子（TNF）相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factorrelated apoptosisinducing ligand，TRAIL）可诱导包括前列腺癌细胞在内的多种
6、肿瘤细胞凋亡，但研究报道至少 50%的肿瘤细胞对 TRAIL耐药1 。3，3 二吲哚基甲烷（3，3diindolylmethane ，DIM）能消除自由基，激活凋亡信号通路，具有较强的抗氧化作用和促进多种肿瘤细胞凋亡作用2 。因此，本文探索 DIM协同 TRAIL对前列腺癌细胞的作用。1 材料与方法1.1 材料 人前列腺癌细胞(PC3 细胞)购自中国科学院。DIM、人重组TRAIL蛋白均购自美国 Sigma公司；胎牛血清、RPMI1640 培养液购自杭州四季青公司，胆囊收缩素/缩胆囊素8(CCK8) 试剂盒购自日本同仁化学研究所，膜联蛋白 V（Annexin V）凋亡试剂盒购自联科生物科技有限
7、公司，兔抗人半脱氨酸蛋白酶（caspase）3 多抗购自 Santa Cruz公司，羊抗兔 IgG二抗购自博士德公司。1.2 方法1.2.1 细胞培养 人前列腺癌细胞 PC3 在 10%胎牛血清的 RPMI1640培养液，37，5% CO2的培养箱中培养。1.2.2 CCK8 法测定 PC3 细胞增殖活性 取对数期生长的 PC3 细胞 2104/孔接种于 96孔圆底培养板，每孔添加 100 l 培养基，培养 18 h后，分别加入化疗药物 DIM（60 l/L） 、TRAIL（2.5 ng/ml）及 DIM（60 l/L）+ TRAIL（2.5 ng/ml）继续培养，每组设 3个复孔，并设阴性对
8、照组（不加化疗药物） 。在培养24、48、72 h各时间点，分别加入 10 l/孔 CCK8 溶液，再经 2 h培养后，酶标仪于 450 nm处测其吸光度（A）值。1.2.3 流式细胞仪检测 PC3 细胞凋亡率取对数期生长的 PC3 细胞 5104/孔接种于 12孔圆底培养板，每孔添加 2 ml培养基，培养 18 h后，分别加入DIM、TRAIL、DIM+TRAIL，浓度同前。于培养 24、48、72 h各时间点，胰酶消化收集各组细胞，磷酸缓冲液（PBS）冲洗后用结合缓冲液悬浮细胞，调整细胞数至 1106，取 100 l 细胞悬液加入 5 l Annexin V 异硫氰酸荧光素（FITC）和
9、10 l 碘化丙啶（PI）混匀后避光 15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率。1.2.4 caspase3 表达测定 分组同上，细胞加药后 24 h提取细胞总蛋白，取 40 g 蛋白进行 10对钠十二烷基硫酸盐 聚丙烯酰胺(SDSPAGE) 凝胶电泳，电泳结束后转移蛋白至 NC膜上，5脱脂奶粉 4封闭过夜，TBST 洗 3次；室温加入 1200 兔抗人 caspase3 多克隆抗体孵育 2 h，TBST 洗膜 3次，加入 11 000 稀释的辣根过氧化物酶结合的羊抗兔 IgG/活化蛋白（AP） ，室温孵育 2 h，TBST 洗膜 3次，电化学发光(ECL)法显色。1.3 统计学处理 采用 SP
10、SS13.0统计软件对数据进行方差分析，数据以 xs表示。2 结 果2.1 DIM 联合 TRAIL对 PC3 细胞增殖活性的影响 TRAIL 与 DIM一样，作用后 24、48、72 h对 PC3 细胞有一定杀伤作用，即细胞生存率明显减低（P0.01） ，而联合用药较单独用药的抑制作用更明显（P0.01） ，且 TRAIL及 TRAIL联合 DIM的作用呈时间效应关系，72 h较 48 h、48 h较 24 h的抑制作用更大（P0.01） ，见表 1。表 1 DIM联合 TRAIL对 PC3 细胞生存率的影响（略)2.2 DIM 联合 TRAIL对 PC3 细胞凋亡的影响 在 DIM、TRA
11、IL 分别作用下，PC3 细胞凋亡率较对照组升高（P0.01） ，而联合用药较单独用药引起的凋亡更明显（P0.01） ，且凋亡呈时间依赖性，即 72 h、48 h与 24 h的凋亡率比较，差异有统计学意义（P0.01） ，见表 2。表 2 DIM联合 TRAIL对 PC3 细胞凋亡率的影响（略)2.3 PC3 细胞 caspase3 表达检测 可见在 DIM、TRAIL 分别作用下，PC3 细胞表达 caspase3 量较对照组升高，而联合用药较单独用药引起的 caspase3 表达增加更明显。见图 1。3 讨 论目前前列癌的治疗主要措施包括手术治疗和药物治疗。由于前列腺癌主要发生于老年男性患
12、者，且易发生骨转移，因此手术治疗具有很大的局限性3 。而前列腺癌经雄激素抑制药物治疗一段时间后，易转化为激素非依赖性肿瘤，雄激素抑制疗法就失去了治疗作用4 。目前对激素非依赖性前列腺癌仍缺乏有效的药物治疗措施5 。TNF一直以来被认为是一种重要的潜在肿瘤化疗药物，TRAIL 便是TNF超家族成员之一，它通过结合相应的死亡受体 TRAILR1 （DR4）和TRAILR2 （DR5）活化凋亡机制6 ，选择性使癌细胞易于凋亡，而不损害正常细胞。本研究观察到小剂量 TRAIL（2 ng/ml）对前列腺癌PC3 细胞有一定抑制生长作用及诱导凋亡作用，且这种作用在给药后24 h发生，随时间延长而加强，72
13、 h 最显著。DIM是吲哚3 甲醇（I3C）的衍生物，研究表明 I3C无论在体内还是体外，都表现出对多种肿瘤防治作用7 。DIM 能够较强地抑制蛋白激酶（Akt）信号传导途径，抑制 Akt的蛋白水平及其磷酸化水平，进而下调雄激素受体水平和抑制其下游的周期调控因子（cyclin）D1、细胞周期依赖性激酶（CDK）4，6，诱导细胞凋亡8 。有研究指出 DIM对人激素非依赖性前列腺癌 PC3 细胞的生长具有抑制作用9 。本研究观察到单独运用 DIM处理 PC3 细胞能抑制其生长及诱导其凋亡，且呈时间依赖性，72 h 后最强，与报道结果一致。本研究中，当联合 DIM与 TRAIL处理 PC3 细胞时，
14、PC3 细胞的生长抑制率和凋亡诱导率较单独用药更明显，且在 24、48 和 72 h时间点均高于单独用药，结果表明联合用药对前列腺癌细胞的抑制作用加强。在 DIM的协同做用下，TRAIL 的抑制肿瘤作用明显增强，为探讨其机制，本文检测了 caspase3 的表达水平。caspase 家族是细胞凋亡发生和调控机制中的重要因素，而 caspase3 是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路，也是凋亡的关键酶和执行者10 。基因敲除实验和动物模型也显示，抑制 caspase3 活性将显著阻滞体外和体内的细胞凋亡11 。研究中发现给药组与对照组相比，各给药组 caspase3 表达上调，联合给药组表达量上调
15、更明显，说明 PC3 细胞的凋亡抑制可能是 caspase3上调所导致。【参考文献】1 Guseva NV， Taghiyev AF，Sturm MT,et al.Tumor necrosis factorrelated apoptosisinducing ligandmediated activation of mitochondriaassociated nuclear factorkappaB in prostatic carcinoma cell linesJ.Mol Cancer Res，2004；2(10):57484.2 Chen DZ，Qi M，Aubom KJ,et al.I
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