1、FACS Aria 流式细胞分选调试参数和最佳条件的设定作者：曹云新, 胡金涛, 杨安钢 【摘要】 目的：探讨 FACSAria 流式细胞仪分选细胞亚群的调试参数和最佳设定条件. 方法: 采用进口分选质控试剂 Accudrop Beads和自配鞘液为材料. 在 FACSAria 流式细胞仪上，对分选液滴的振荡频率(Freq)、振动幅度（Ampl）和液滴间隔值（Gap）进行调试，摸索分选的最佳设定值. 结果：使用 100 mm 喷嘴，主液流窗 Ampl 设定为302，Gap 灰带宽度为(2.00.5) mm，侧液流断点窗 4 个分叉斑点直径调为(20.2) mm，4 叉液流束光斑调至集中明亮，边
2、界清晰，液滴偏转延时值为 251 附近，调试效率最高. 其分选纯度可达 99%, 分选回收率可达 98%. 结论: 流式分选条件的设定和建立，对于提高分选细胞活性，获得高纯度和高回收率的细胞，提供了快速调试的途径. 【关键词】 流式细胞术；分选; 细胞；条件 【Abstract】 AIM: To find the optimal adjustment conditions and parameters for sorting cell subsets with FACSAria flowcytometer. METHODS: Using imported sorting quality con
3、trol Accudrop Beads and selfmade sheath fluid as materials, we kept adjusting the oscillation frequency and amplitude (Ampl) and the gaps between drops (Gap) of the sorted sample until an optimal configuration for the sorting was found and set. RESULTS: Using the 100 um nozzle, the mainstream window
4、 Ampl was set at 302, the Gap width at (2.00.5) mm, and each spot of the four forks in the side stream breakoff point window was (20.2) mm, the light spot of the 4 fork streams was adjusted until it was focused and bright and had clear boundaries. When the drop declination delay value was 251, the a
5、djustment efficiency reached its optimum, with its purity at 99% and sorting recovery rate at 98%. CONCLUSION: Rapid adjustment and fixing of the conditions for sorting with flow cytometry is of substantial significance to the purity, activity and precision of the sorted cells as well as the stabili
6、ty, efficiency and success of sorting. 【Keywords】 flow cytometry; sorting; cell; conditions 0 引言 在流式细胞分选前的参数设定和调试是细胞分选的关键性工作，它的好坏与快慢，直接影响细胞分选的效率、纯度和精度. 目前国内外对于分选技术方法学研究和探讨的文献报道并不多见1-2. FACSAria流式细胞仪是集临床和科研为一体的高精密分析和高速细胞分选的仪器，其主要用途是从细胞群中高速分选出被指定的细胞、细胞器或质点，以便做进一步细胞鉴定、功能研究或细胞克隆培养，其分选速度之快是其它方法无法比拟的3-4.
7、由于分选之前仪器的条件设置和调试比较繁琐、费时,如果不能很好地掌握这些参数和条件的设置技巧，将会对分选细胞的效率、纯度、精度以及活性的保持产生较大影响. 为最大限度地发挥仪器的功能和效率， 我们对细胞分选调试的参数和最佳条件的设定做了一些探索和研究. 1 材料和方法 1.1 材料 FACSAria 分选型流式细胞仪, 稀释鞘流液 FACSFlow， 溶血液和分选质控试剂 Accudrop Beads 等均为美国 Becton Dickinson 公司产品；QPrep 型免疫学样品制备仪，美国 Beckman Coulter 公司产品；分选所用标本为第四军医大学西京医院查体健康人肝素抗凝全血.
8、1.2 方法 1.2.1 样品制备将 Accudrop Beads 用 FACSFlow 液稀释后备用，分选样品用含肝素的真空采血管收集抗凝血 23 mL,充分混匀，每份取100 mL 全血样品加入 CD4FITC 和 CD8PE 避光染色 30 min, 上QPrep 型免疫学样品制备仪,溶解红细胞，稳定和固定白细胞，3 h 内上机分析和分选. 1.2.2 主液流调校观察主液流窗的主液滴和卫星点及液流断点位置状况：将主液流断点窗的 Stream 打开，并设为中速（应用 70 mm 喷嘴）,相对固定液滴振荡频率（Freq）,调液滴振动振幅（Ampl） ，使第 1 液滴的值落在 240 附近，液
9、滴间隔值（Gap）尽量恒定,使液流断点位于窗口的中上部. 1.2.3 侧液流调校打开侧液流窗的高压，激活分选测试（Test sort）窗. 此时运用主液流窗中的 Ampl 调试，使四束偏转液流和废液流 5 个光斑间距尽可能地拉开，各光斑调至明亮、集中. 此后安装两路或四路分选收集管装置. 打开分选窗，点开分选门，观察偏转的分选液流是否落入分选相应的收集管正中. 如果没有，可轻轻左右拉动侧液流窗的电压滚动条，使分选液流准确落入收集管中. 之后关闭分选电压. 将主液流窗中实际调出的 Drop1 值添到 Drop1 默认窗口中. 液流调整好后的Gap 值应在默认值3 的范围内. 1.2.4 确定液滴
10、偏转延迟加电时间建立一个新的实验文件夹，再建立两个子文件夹(Specimen 和 Tube). 在右侧电脑的通用工作页面上建立获取模板，用横轴 FSCA 和纵轴 SSCA 建立一个散点图，并设单个微球的矩形门 P1. 点击 Tube 使其变为绿色的采集箭头,打开分选窗口，在Device 窗口中将选项设为 2 Tube，在 Precision 中选为 Initial，在Target events 选项中选为 Continuous. 赋予 Left 为 P1. 上样已稀释的Accudrop beads，调整细胞流速为每秒 20004000 个，打开分选电压，点击滤光片图标（Optical Filt
11、er）. 此时，侧液流窗口出现两个框，调整 Drop delay 值，使左框中粗调和细调的光斑值均大于等于 95%. 2 结果 21 主液滴、卫星点及液流断点最佳位置主液流窗中主液滴、卫星点及液流断点最佳位置，Gap 灰带的适中位置在主液流窗的中上部，主液滴各滴形状规则，卫星点融入液滴良好（图 1A）. 而 Gap 灰带位置落的较高时，液滴无规则形状，无卫星点出现(图 1B). 若调试不合理，卫星点太多（图 1C）. 图 1DF 也均属调试不佳，无法进行正常分选的图形. 2.2 侧液流断点窗 5 叉斑点状况 4 个分叉斑点直径应在 2 mm 左右,中间废液斑点应在 4 mm 左右. 此外，如果
12、看不到左边两束的斑点，可用下方摄像头的螺钉调整，直到光斑较亮较粗为止. 下方摄像头螺钉主要是用来调激光照明灯亮度强弱的， 当调到最佳位置时， 激光灯珠最亮，此时 4 叉液流会显示的很清除. 2.3 CD4+ T 和 CD8+ T 淋巴细胞亚群分选结果人全血经 CD4 异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）和 CD8 藻红蛋白(phycoerythrin，PE)直接标记染色后，分别获得的 CD4 T 和 CD8 T淋巴细胞亚群分选结果（图 2） ，分选纯度为 99%, 回收率达到 98%. 说明仪器的分选参数设置正确,仪器分选处于最佳状态.3 讨论 流式细
13、胞分选是现代细胞分析领域重要的技术之一5. 流式细胞分选功能主要是由细胞分选器来完成, 其原理是由喷嘴射出的液流柱在电信号作用下发生振动,断裂形成均匀的小液滴. 系统根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选,而后由充电电路对选定细胞液滴充电,带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转,落入收集器中, 使用不同孔径的喷嘴及改变液流速度,都可能会改变分选效果6. 从参数测定经逻辑选择再到脉冲充电需要一段延迟时间. 精确的调校仪器参数和设定液滴的延迟偏转时间是决定分选质量的关键,可根据具体要求进行适当调整. 我们在调试中发现，刚开机时主液流窗常常出现图 1E 和图 1F 所示的不规则图形. 此时不要急
14、于调整 Ampl 等参数，而应先开关几次Stream，待液流断点出现图形有所改善后，再调试 Amp1,Freq, Drop1,Gap 和 Drop delay. 调整主液流液滴断点位置和卫星点时，Amp1的值应70,如果70 仍然无法调好，应立即关闭液流，然后反复开关23 次. 若仍无效果，应检查喷嘴，看是否堵塞. 卸下喷嘴超声清洗后再重新调试，确保卫星点融入主液滴的位置正确. 主液流中的卫星点用100 mm 喷嘴时应不大于 3 个，而 70 mm 喷嘴不大于 5 个, Gap 框外的值结合 Ampl 做微小调试，使其达到恒定并不再有太多波动，即可获得如图1A 理想的调试结果. 而调侧液流断点
15、窗 5 叉斑点时，如出现液流分束不清楚、有毛刺，可进一步调整主液流窗的 Ampl，也可以同步调整侧液流窗中的 2nd 和 3nd Drop，给这些液滴的加电量添加一个适当的补偿因子，使之达到液流分束明亮、集中、清楚. 液滴延迟时间能否快速调整好，与 Accudrop Beadsd 的稀释浓度和 P1 门是否赋予分选窗，以及分选窗中的 Sort 是否打开有很大关系. 液滴延迟用于设置细胞检测点与断点处之间的时间间隔，通常为 10140 液滴间隔，调整液滴延迟数值决定了即将偏转的液滴的加电时间，调试时应遵循的规律是 Drop 值愈小，Drop delay 应愈小. 综上所述，该方法可以快速、准确地
16、设置流式细胞仪的分选参数. 对于做 6，24，96 孔板和载波片分选细胞也非常实用，可为使用流式细胞仪进行细胞亚群分选的科研人员提供一定的参考价值. 【参考文献】 1Francisco JA, Campbell R, Iverson BL, et al. Production and fluorescenceactivated cell sorting of Escherichia coli expressing a functional antibody fragment on the external surfaceJ. Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 90(2
17、2): 10444-10448. 2Lekkerkerker A, Logtenberg T. Phage antibodies against human dendritic cell subpopulations obtained by flow cytometrybased selection on freshly isolated cellsJ. J Immunol Methods, 1999, 231(12):5363. 3Georgiou G, Stathopoulos C, Daugherty PS, et al. Display of heterologous proteins
18、 on the surface of microorganisms: From the screening of combinatorial libraries to live recombinant vaccinesJ. Nat Biotechnol, 1997, 15(1): 29-34. 4何小军, 胡静, 夏云, 等. 流式细胞术检测临床实体瘤细胞周期蛋白表达的方法研究J. 中国实验诊断学, 2007, (01): 20-23. 5辛忠涛. 流式细胞分选技术在微生物表面展示文库筛选中的应用进展J. 微生物学免疫学进展, 2003, (03)：62-66. 6徐勇. 免疫磁珠分离及流式细胞仪分选纯化外周血CD34+/CD90+干细胞J. 临床检验杂志，2004, (04)：871-873.
