1、HBV 持续感染患者调节性 T 细胞检测及其意义作者：赵爽 孙均 周培培 徐娟 颜学兵 【摘要】 目的研究调节性 T细胞(Treg)在慢性乙型肝炎(CHB)发病机制中的作用，为寻找治疗 CHB的新方法奠定基础。方法用流式细胞仪检测了 75例 CHB患者和 30例慢性乙型肝炎病毒(HBV)携带者外周血中 Treg含量，CHB 患者中 HBeAg阳性患者 39例，HBeAg 阴性患者 36例，慢性HBV携带者中 HBeAg阴性和 HBeAg阳性患者各 15例。并对其中 23例 CHB患者服用核苷(酸)类似物前后外周血 Treg含量进行检测。结果 CHB患者外周血 Treg含量明显高于慢性 HBV携
2、带者(P0.05)，而 CHB和慢性HBV携带者中 HBeAg阴性和 HBeAg阳性患者外周血 Treg含量均无明显差异(P0.05)。经核苷(酸)类似物治疗 12周后，CHB 患者外周血 Treg含量较治疗前有所降低(P0.05)。结论 Treg在 HBV致病机制中起一定的作用，体外调控 Treg含量和功能可能为治疗 HBV感染提供一个新的途径。 【关键词】 慢性乙型肝炎;慢性 HBV携带者;调节性 T细胞 Abstract: ObjectiveTo investigate the role of T regulatory cell (Treg) in the pathogenesis of
3、 chronic hepatitis B (CHB) and lay the basis for new therapy of CHB. Methods In 75 patients with CHB and 30 HBV carriers underwent determination of Treg levels in the peripheral blood by flow cytometry, of whom there were 39 HBeAg-positive patients, 36 HBeAg-negative patients, 15 HBeAg-positive carr
4、iers and 15 HBeAg-negative carriers. The Treg levels in the peripheral blood were determined before and after administration of nucleos(t)ide analogues in 23 CHB patients. ResultsThe Treg levels in the peripheral blood in CHB patients were significantly higher than those in the chronic HBV carriers
5、(P0.05), while there was no significant difference in Treg levels in the peripheral blood betweenHBeAg-positive and HBeAg-negative CHB patients and chronic HBeAg carriers (P0.05). 12 weeks after nucleos(t)ide analogue therapy, Treg levels in the peripheral blood in CHB patients had a statistical dec
6、rease compared with the baseline (P0.05). ConclusionTreg plays an important role in the pathogenesis of CHB. External regulation of the level and function of Treg might provide a new means for the therapy of HBV infections. Key words: chronic hepatitis B; chronic HBV carrier; T regulatory cell CD4+C
7、D25+调节性 T细胞(T regulatory cell，Treg)是重要的免疫抑制细胞1，几乎抑制所有的免疫反应，在机体免疫系统中发挥负向调节作用。其最明确的功能标志是对 CD4+T细胞和 CD8+T细胞的增殖及细胞因子分泌的抑制功能。目前认为 CD4+CD25+ Treg可以抑制细胞毒性 T细胞(cytotoxic cell，CTL)反应及其功能和干扰素-(interferon-，IFN-)的分泌，对于乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染慢性化可能起到关键性的作用。但关于 Treg的研究还处于起步阶段，国内外研究对于慢性 HBV感染患者外周血中 CD4+CD25
8、+Treg的比例是否升高仍有争议。我们分析目前研究中 Treg的比例检测的差异可能主要是由于当前对 Treg界定及检测方法不同所致。研究小组多采用流式荧光技术，通过检测细胞表面的抗原分子，同时结合 Foxp3mRNA的表达水平来判定CD4+CD25+Treg的含量。Foxp3 虽被认为是 Treg的特异性标志，但其属于胞内蛋白，检测时需细胞破膜处理，可能会影响检测的结果和下游的实验，故检测结果并不稳定。我们的实验用流式细胞仪检测 Treg表面双标志物 CD4+/CD25+的方法，研究慢性乙型肝炎(chroinc hepatitis B，CHB)患者和慢性 HBV携带者外周血 Treg含量的差异
9、以及核苷(酸)类似物治疗前后 Treg含量的差异，以研究 Treg在 HBV致病机制中的作用，为临床治疗 CHB提供理论依据。 1 资料和方法 1.1 研究对象和分组 75例 CHB患者和 30例慢性 HBV携带者来自2006年 12月2008 年 6月徐州医学院附属医院感染性疾病科住院和门诊患者，其中男性 65例，女性 40例，年龄 1860 岁，平均年龄(41.84.6)岁。正常对照组(NC)20 例来自徐州医学院附属医院健康体检中心，既往身体健康，无其他基础病，其中男性 11例，女性 9例，平均年龄(404.2)岁。CHB 组中 HBeAg阳性患者 39例，HBeAg 阴性患者 36例，
10、慢性 HBV携带者中 HBeAg阴性和 HBeAg阳性患者各 15例。CHB 患者中有 27例服用核苷(酸)类似物治疗(其中 4例患者在治疗 12周前失访，10例服用恩替卡韦，13 例服用阿德福韦酯)。CHB 诊断依据 2000年西安全国病毒性肝炎会议制定的诊断标准，排除甲型肝炎、丙型肝炎、戊型肝炎、药物性和酒精性肝病、自身免疫性肝病等。 1.2 标本的收集与处理所有患者采外周血 1 ml用 EDTA抗凝，直接用流式细胞仪检测 CD4、CD25。 1.3 流式细胞仪检测 CD4、CD25 抗体购于杭州联科公司。将相应抗体分别加入 2只空白离心管中，分别为阳性管和阴性管，每管分别加入抗凝外周血
11、100 l，充分混匀，4 避光 20 min。在全血样本中加入溶血剂 1 ml，混匀放置 10 min,全血样本 PBS洗涤 3次，培养管洗 1 次，沉淀用 200 l PBS 悬浮，上流式细胞仪检测。 1.4 统计学处理 SPSS 11.0统计软件对数据进行分析，计量资料两组间比较采用 t检验。P0.05 认为差异有统计学意义。 2 结果 2.1CHB 患者和慢性 HBV携带者外周血 Treg含量比较 CHB组外周血Treg含量明显高于慢性 HBV携带者(P0.05)，见表 1。 表 1CHB患者和慢性 HBV携带者 Treg含量比较 2.2CHB 患者中 HBeAg阳性与阴性患者外周血 T
12、reg含量比较 CHB患者中 HBeAg阳性与阴性患者外周血 Treg含量比较无明显差异(P0.05)，见表 2。表 2Treg含量比较 2.3HBV 携带者 HBeAg阳性与阴性患者外周血 Treg含量比较 HBV携带者 HBeAg阳性与阴性患者外周血 Treg含量无明显差异(P0.05)，见表 3。表 3Treg含量比较 2.4 核苷(酸)类似物治疗前后 Treg含量比较经核苷(酸)类似物治疗12周后外周血 CD4+、CD25+、Treg 含量均有所下降，差异具有统计学意义(P0.05)，见表 4。表 4核苷(酸)类似物治疗前和治疗 12周后比较 3 讨论 目前全世界 CHB发病率高，CH
13、B 相关的肝硬化和肝癌的病死率也逐年增加，严重威胁着人类的健康。但是 HBV感染后慢性化的确切机制尚不明确，所以目前尚无有效的治疗方法和方案。因此，明确 HBV感染慢性化的发病机制，可为 CHB的临床治疗提供新的线索和可靠的理论依据。 近年来认为乙肝免疫学治疗的关键在于如何打破免疫耐受状态，诱导有效的机体免疫，抑制并清除 HBV。但因 CHB的免疫发病机制不明确，尚无可行的方法。目前发现 Treg对 CD4+、CD8+T 细胞、B 细胞和 NK细胞等多种天然和适应性免疫应答有广泛的抑制作用2。研究表明，机体可能更主要的是通过 Treg以“主动”的方式来获得和维持自身耐受。Treg尤其在病原体的
14、慢性持续性感染过程中起到维持免疫耐受的作用3。在对丙型肝炎病毒、艾滋病病毒的研究中提示 Treg可抑制 T细胞的增殖和功能因子的分泌。而其在慢性肝炎中的抑制作用，则很可能促进了病毒的持续感染4。我们的研究提示 CHB患者外周血 Treg含量明显高于慢性 HBV携带者，提示 Treg在慢性乙型肝炎的免疫耐受中起一定的作用。Treg的存在可能使 HBV和机体的效应细胞之间维持一种稳态，既可以使机体维持保护性免疫，避免激发过度的免疫反应而引起肝脏组织病理损害，但也会造成病毒在机体的持续存在。研究报道肝脏能够通过肝窦内皮细胞作为抗原提呈细胞诱导 CD4+T细胞转变为免疫抑制状态的细胞表型5。是否能通过
15、调节 Treg的功能，增强乙型肝炎特异性免疫而寻找到治疗 CHB的方法，我们已经加大样本量进行进一步研究。 有关 CD4+ CD25+ Treg与 HBeAg阳性和阴性的关系，报道不一。Stoop等6比较了 24例 HBeAg阳性和 26例 HBeAg阴性患者外周血中CD4+ CD25+Treg的含量，认为 HBeAg阳性患者的 Treg明显高于 HBeAg阴性的患者，而 Franzese和福军亮等7-8的研究认为外周血 Treg含量在HBeAg阴性与 HBeAg阳性 CHB患者中无统计学差异。我们的研究显示 CHB和慢性 HBV携带者中 HBeAg阴性和 HBeAg阳性患者外周血 Treg含
16、量无明显差异。这与 Franzese和福军亮等的研究结果相似。 抗病毒治疗是目前 CHB患者的主要治疗方法。目前的抗病毒药物主要有 IFN- 和核苷类药物。核苷类似物治疗的主要作用是通过抑制病毒复制而减少肝细胞炎症，从而减少肝硬化和肝癌的发生率。目前尚没有抗病毒药物影响宿主免疫功能的明确证据。我们的研究提示经核苷(酸)类似物治疗 12周后，外周血 Treg含量均较治疗前有所降低，而 Treg 的减少与低表达将使机体被抑制的免疫反应有所恢复。Stoop、Franzese 的研究小组均认为 CD4+CD25+ Treg外周血含量与病毒载量之间无明显的关联，这与我们实验的前期研究结果(外周血 Tre
17、g含量与 HBV DNA无明显相关性)相符9。我们推测经核苷(酸)类似物治疗后 Treg的下降与低表达可能会导致患者免疫功能的部分恢复，以利于机体内病毒的清除。我们的实验说明经过抗病毒治疗，可以一定程度上改善患者的免疫功能。我们的研究结果有利于进一步揭示 Treg与 HBV感染慢性化的关系，为发展针对 HBV感染的免疫治疗提供新的思路。 【参考文献】 1Sakaguchi S, Sakaguchi N, Asano M, et al. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 recep
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