1、IL-27 亚基基因真核表达质粒的构建与表达作者：程晓刚 叶琬 邹强 陈玮 金虹 徐艳 张绍兰 冷言冰 李晋川 【摘要】 目的 克隆人白细胞介素 27（interleukin 27，IL-27）蛋白亚基 EB 病毒诱导的基因 3（Epstein-Barr virus-induced gene 3，EBI3)与 p28 基因的 cDNA，分别构建其真核表达质粒并在 COS-7 细胞表达。 方法 人外周血单核细胞诱导为成熟树突状细胞后提取细胞总RNA，经逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增 EBI3 与 p28 基因 cDNA，酶切后插入 pcDNA-3.1 构建真核表达载体 pcDNA-EBI
2、3 与 pcDNA-p28。重组质粒转染 COS-7 细胞，RT-PCR 检测目的基因表达。结果 成功构建克隆人 IL-27 蛋白亚基真核表达质粒，重组质粒分别转染 COS-7 细胞后检测到相应基因表达。结论 人 IL-27 蛋白亚基基因克隆及真核表达质粒的成功构建，为构建表达有生物学活性的重组人单链 IL-27 蛋白奠定基础。 【关键词】 IL-27；基因克隆；真核表达 Abstract: Objective To clone and construct the eukaryotic expression plasmids containing human IL-27 protein sub
3、units and investigate their expression following transfection into COS-7 cells. Methods Total RNA was extracted from dendritic cells derived from human peripheral blood monocytes for cloning EBI3 cDNA and p28 cDNA by RT-PCR. The eukaryotic expression plasmids pcDNA-EBI3 and pcDNA-p28 were constructe
4、d and transfected into COS-7 cells, where the expressions of target gene were detected by RT-PCR. Results The IL-27 protein subunits cDNA were cloned and the constructed plasmids were verified to be correct by sequencing. Target gene expressions were detected by RT-PCR in the transfected COS-7 cells
5、. Conclusion The eukaryotic expression plasmids containing human IL-27 protein subunits were constructed and expressed in COS-7 cells successfully. This work paves the way for construction and expression of the bioactive single chain human IL-27 protein. Key words: IL-27； gene clone； eukaryotic expr
6、ession 细胞因子白细胞介素 27（interleukin 27，IL-27） 1是近年来发现的由 EB 病毒诱导的基因 3（Epstein-Barr virus-induced gene 3，EBI3)与 p28 蛋白构成的异二聚体蛋白，EBI3 为近年来发现的由 EB 病毒诱导的恶性肿瘤所表达的蛋白2 ，EBI3 在体内与 p28 蛋白结合形成的细胞因子 IL-27 具有重要的免疫调节功能。实验表明 IL-27 可诱导童贞 T 细胞 Th1 极化，促进 T 细胞和自然杀伤(NK)细胞分泌 IFN- 而促进细胞免疫应答，因而可诱发特异性的抗肿瘤免疫3 。本研究旨在克隆人 IL-27 蛋白
7、亚基 EB 病毒诱导的基因 3（EBI3）与 p28 基因的 cDNA，构建真核表达质粒 pcDNA-EBI3 与 pcDNA-p28 并在 COS-7 细胞表达，为构建与表达有生物学活性的单链重组人 IL-27 蛋白奠定基础。 1 材料和方法 1.1 质粒和菌株 真核表达质粒 pcDNA3.1(+)（5.4 kb) 、大肠杆菌 E.coli DH5 菌株、非洲绿猴肾细胞 COS-7 为本室保存。 1.2 主要试剂和器材 载体连接试剂盒、限制性核酸内切酶、DNA凝胶回收试剂盒、PCR 试剂购自 Takara 公司，质粒抽提试剂盒购自Omega 公司，Trizol 为 Invitrogen 公司
8、产品，RevertAidTM cDNA 第一链合成试剂盒为 Fermentas 公司产品，DOTAP 脂质体转染试剂盒为 Roche 公司产品，rmIL-4 与 rmGM-CSF 蛋白购自 Cytolab 公司。细胞生长液 RPMI 1640 培养基为 GIBCO BRL 公司产品，新生小牛血清购自兰州民海生物工程有限公司，单核细胞分离液为成都豪乙生物科技有限公司产品，其他试剂为进口或国产分析纯。 1.3 引物设计 据文献报道基因序列设计引物：EBI3 上游引物(P1)：自 EBI3 起始密码 ATG 起始， 5端含 Hind酶切位点P:5CCCAAGCTTATGACCCCGCAGCTTCTC
9、CT 3，EBI3 下游引物(P2)：自终止密码 TAG 开始，5端含 EcoR V 酶切位点,5CGATATCCTACTTGCCCAGGCTCATTG 3。 p28 上游引物(P3)：自 p28 起始密码 ATG 开始，5端加入 Hind 酶切位点，5CCCAAGCTTATGGGCCAGACGGCAGGCGA 3，p28 下游引物(P4)：自终止密码 TGA 开始，5端加入 EcoR 酶切位点，5GGATATCTCAGGGCTGGGGGCTCAATG3。上述引物由上海博亚生物技术有限公司合成。 1.4 pcDNA-EBI3 与 pcDNA-p28 质粒的构建 分离人外周血单核细胞，细胞密度为
10、 5108/L，经 rmGM-CSF(100 g/L)与 rmIL-4(100 g/L)诱导 7 天后经 LPS（1 mg/L）刺激 6 h 后，收集诱导成熟的树突状细胞，提取细胞总 mRNA，按 Fermentas 公司提供的 cDNA 第一链合成说明进行逆转录反应获得 cDNA，随之进行聚合酶链反应(RT-PCR)获得 EBI3 与 p28 基因编码序列的 cDNA，反应条件：951 min，进入循环，94 1 min，60 1 min，72 1 min，共 30 个循环,最后 72 延伸 10 min 。取 RT-PCR 产物行 10 g/L 琼脂糖凝胶电泳回收纯化后，将扩增产物经 Hi
11、nd 与EcoR 酶切，插入上述酶切线性化的 pcDNA-3.1(+)载体, 连接后转化DH5 感受态菌,培养后挑取白色单菌落，小量提取质粒 DNA 进行酶切鉴定，命名为 pcDNA-EBI3 与 pcDNA-p28，并送至上海鼎安生物科技有限公司进行插入 DNA 序列测定。 1.5 重组质粒的细胞转染与表达 对数生长期 COS-7 细胞培养于RPMI 1640 培养液中，将 2105 个细胞接种于 6 孔板培养 24 h，待细胞生长至 7080融合时，采用 Roche 公司的 DOTAP 脂质体转染试剂盒包裹重组质粒，按照试剂使用说明转染细胞，10 h 后弃去转染液，换新鲜培养基继续培养 4
12、8 h，分别收集实验孔及阴性对照、空白对照孔的细胞，提取细胞总 RNA，RT-PCR 检测细胞 EBI3 与 p28 基因表达。 2 结 果 2.1 人外周血单核细胞细胞诱导成为树突状细胞 分离正常人外周血单核细胞，经 rmGM-CSF(100 g/L)与 rmIL-4(100 g/L) 诱导后第7 天发育为树突状细胞，细胞体积明显增大，呈集落贴壁生长，并有树枝状突起。经 LPS（1 mg/L）刺激 12 h 后，细胞表面突起明显，树突状细胞发育成熟（图 1） 。 图 1 人外周血单核细胞经 IL-4 与 GM-CSF 诱导 7 天后成为树突状细胞 2.2 RT-PCR 扩增人 EBI3 与
13、p28 基因 取 LPS 刺激的树突状细胞总RNA，进行 10 g/L 琼脂糖凝胶电泳，紫外线灯下可见 3 条清晰条带，分别为 5S、18S、28S。将 RTPCR 产物分别进行 10 g/L 琼脂糖凝胶电泳，可见 2 条亮带，大小分别约 710 bp 和 750 bp，与 EBI3 与 p28 基因 cDNA片断预期大小相符（图 2） 。 图 2 人 EBI3 与 p28 基因 cDNA 扩增结果 1. EBI3 基因 cDNA RT-PCR 产物；2. p28 基因 cDNA RT-PCR 产物；M. DL2000 DNA marker2.3 pcDNA-EBI3 与 pcDNA-p28
14、真核表达质粒的构建 经 Hind 与 EcoR 双酶切后的人 EBI3 cDNA 与 p28 cDNA 的 PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳回收后与上述酶酶切后的 pcDNA3.1 进行定向连接，连接后转化 DH5 感受态菌。抽提质粒，进行 Hind 与 EcoR V 双酶切鉴定，经 10 g/L 琼脂糖凝胶电泳结果与预期相符，DNA 测序结果与 EBI3和 p28cDNA 序列一致（图 3、4） 。 2.4 重组质粒在 COS-7 细胞中的表达 分别收集未转染、pcDNA-EBI3、pcDNA-p28 与空载体 pcDNA3.1 转染的 COS-7 细胞，经逆转录得到cDNA 模板进行 PCR
15、扩增。结果表明，从重组质粒转染的 COS-7 细胞中可分别扩增出 EBI3 基因与 p28 基因，而空质粒转染和未转染细胞中未扩增出目的条带（图 5） 。 图 3 pcDNA-EBI3 与 pcDNA-p28 真核表达 质粒酶切鉴定结果 M. DL2000 DNA marker；1. pcDNA3.1/Hind +EcoR ；2. pcDNA3.1； 3. pcDNA-EBI3/Hind +EcoR；4. pcDNA-EBI3； 5. pcDNA-p28/Hind +EcoR；6. pcDNA-p28 图 4 pcDNA-EBI3 真核表达质粒测序结果 图 5 重组质粒转染 COS-7 细胞中
16、目的 基因的 RT-PCR 检测 1. 未转染/p28 引物扩增；2. pcDNA3.1 转染/ p28 引物扩增；3. pcDNA-p28 转染/p28 引物扩增；M. DL2000 DNA marker；4. pcDNA-EBI3转染/EBI3 引物扩增；5. pcDNA3.1 转染/EBI3 引物扩增；6. 未转染/EBI3 引物扩增 3 讨 论 IL-27(EBI3-p28)1是近年发现的 IL-12 超家族的新成员，IL-27是由 IL-27 p28 和 IL- 27 EBI3（EB 病毒诱导的基因 3 蛋白2 、Epstein-Barr virus-induced gene 3、E
17、BI3）两亚基构成的异源二聚体。IL-27 表达主要限于髓细胞系，主要由 LPS 等活化的单核细胞和树突状细胞等抗原递呈细胞产生。其受体为 WSX-1/TCCR（T 细胞的细胞因子受体、T-cell cytokine receptor）和 gp130 构成的异源二聚体4 ，主要表达于人淋巴组织如胸腺和脾脏和外周血淋巴细胞尤其是 CD4()T 细胞和NK 细胞表面。实验表明,TCCR/WSX1 活化对启动 Th1 极化有重要作用5 。提示 IL-27 在诱导 T 细胞分化为 Th1 的过程中起重要作用，并可增强细胞介导的免疫反应。实验表明肿瘤局部表达 IL-27 可产生细胞依赖性和非依赖性的抗肿
18、瘤反应3 ，因此 IL-27 有潜在的临床应用价值。 正常的未被激活的静止的抗原递呈细胞存在有 IL-27 亚基的低水平转录。本实验中我们采用 LPS 活化诱导后的树突状细胞使其高表达 EBI3与 p28 mRNA，LPS 活化后的 6 h 和 12 h 均检测到树突状细胞 EBI3 与 p28的表达，并采用 RT-PCR 的方法合成了 EBI3 与 p28cRNA。根据载体的序列特点，合成 PCR 引物时，在引物的 5端引入相应的限制性内切酶酶切位点，这样合成的 cRNA 只需用适宜的限制性内切酶消化后即可产生有效的定向连接末端，便于与酶切后的载体连接，实验直接将 cRNA 与目标载体连接，
19、省去 T/A 克隆，使实验过程更加简便快速。 本实验所克隆的 EBI3 与 p28 编码序列的 cDNA 序列与文献报道一致，构建的 pcDNA3.1/EBI3 与 pcDNA3.1/EBI3 质粒阅读框架正确， 构建质粒转染 COS-7 细胞成功检测到 EBI3 与 p28 基因的表达，本实验为进一步构建与表达具有生物学活性重组人单链 IL-27 蛋白奠定了基础。 【参考文献】 1 Pflanz S， Timans JC， Cheung J， et al IL-27，a heterodimeric cytokine composed of EBI3 and p28 protein， indu
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