1、hURAT1 基因 3非编码区 SNP 筛查及与原发性高尿酸血症的关系作者：吕森森 吴秀英 韩琳 王瑶 李长贵 【摘要】 目的 在人尿酸盐转运蛋白 1（hURAT1）基因 3非编码区（3UTR 区）筛查与原发性高尿酸血症关联的单核苷酸多态性（SNP） 。方法 对原发性高尿酸血症病人 273 例、健康体检者 429 例（正常对照组），采用酚-氯仿法提取外周血白细胞基因组 DNA，特异性引物扩增 3UTR区，并进行基因测序，对基因型及频率进行分析。结果 共检测到 3 种SNP，分别为 1925 GA、del G 1951 及 G 2174 A，上述 SNP 位点所组成的基因型频率在高尿酸血症病人组
2、和正常对照组差异无显著性。2 例原发性高尿酸血症病人 hURAT1 基因 3UTR 区第 1827-1828 位 2 个碱基缺失（del TC 1827-1828） ，这 2 例病人的血尿酸水平明显高于其他病人，正常对照组未检测到该缺失。结论 3UTR 区存在 3 个 SNP 位点,其中del TC 1827-1828 位点可能是原发性高尿酸血症致病位点。 【关键词】 高尿酸血症；人尿酸盐转运蛋白 1；基因型；基因频率；单核苷酸多态性 ABSTRACTObjective To find new single nucleotide polymorphisms （SNP） in 3-untrans
3、lated region （3UTR） of urat1 related to primary hyperuricemia.Methods This study consisted of 273 patients with primary hyperuricemia （PH）, and 429 healthy volunteers. DNA was purified from peripheral blood and 3UTR of the URAT1 gene was sequenced. The genotype and its frequencies were analyzed.Resu
4、lts Three kinds of SNP were found: 1925 GA, del G 1951 and G 2174 A. The differences of genotype frequencies between the groups were not significant. The del TC 1827-1828 was absent in two patients, but no absence observed in healthy volunteers. These two patients showed a higher serum uric acid （57
5、3 mol/L,630 mol/L VS 499.69136.08 mol/L） than the rest in the same group. Conclusion Three SNP sites were detected in 3UTR region, in which, the del TC 1827-1828 is likely to be the pathogenic site of hyperuricemia. KEY WORDSHyperuricemia; Human urate transportor 1; Genotype; Gene Frequency; Single
6、nucleotide polymorphism 人尿酸盐转运蛋白 1（hURAT1）是位于近端肾小管上皮细胞特异表达的尿酸转运蛋白，是维持血尿酸水平的关键离子通道，是原发性高尿酸血症的重要候选基因。国内外以及我们课题组的研究结果表明，该基因的单核苷酸多态性（SNP）和突变与血尿酸水平密切相关19 。目前发现的 SNP 和突变位点主要位于 hURAT1 基因的外显子、内含子和启动子区域，在 3非编码区（3UTR 区）尚未发现与原发性高尿酸血症密切相关的 SNP 位点。3UTR 在基因的转录调控中发挥重要作用1013 。3UTR 的基因变异虽然不直接改变 hURAT1 基因的编码序列，但可引起hU
7、RAT1 基因功能的改变。原发性高尿酸血症是多基因遗传性疾病。同一基因不同位点的 SNP 和突变均可参与原发性高尿酸血症的发病。本研究对 273 例原发性高尿酸血症病人和 429 例正常体检者 hURAT1 基因 3UTR区 SNP 和突变位点进行筛查，以期发现与原发性高尿酸血症相关的 SNP或突变位点。现将结果报告如下。 1 对象和方法 1.1 研究对象 原发性高尿酸血症病人（病人组）273 例，男 228 例，女 45 例；年龄 1685 岁，平均（49.8815.06）岁。病人均来自青岛大学医学院附属医院内分泌科病房和门诊。原发性高尿酸血症诊断参照第 6 版内科学教材，即绝经前女性尿酸3
8、50 mol/L，男性和绝经后女性尿酸420 mol/L。排除因肾脏、肝脏、心脏、血液病及药物等引起的继发性高尿酸血症。选取同期健康体检者 429 例作为正常对照组，其中男224 例，女 205 例；年龄 2086 岁，平均（42.9813.67）岁。所有研究对象均无高尿酸血症或痛风病史及家族史，无心脏、肾脏、肝脏等器质性疾病。 1.2 研究方法 1.2.1 外周血 DNA 抽提 酚-氯仿法抽提外周血白细胞基因组 DNA。用红细胞、白细胞裂解液裂解红细胞和白细胞，加入蛋白酶 K 后 45 消化过夜。次日加入等体积新配制的苯酚-氯仿-异戊醇（25241）混合液，抽提 DNA。双蒸水溶解至 50
9、mg/L 备用。 1.2.2 目的片段的扩增和基因型分析 多聚酶链反应（PCR）扩增 URAT1 基因的 3UTR，扩增片段长度为 1 112 bp,上游引物 5-TGGCATTCCCTG-GAGTCCTT-3，下游引物 5-CACAACAGGCGCT-GGAAAC-3。 20 L 反应体系包括：10Taq reaction Buffer 2 L，25 mol/L MgCl2 1 L，10 mmol/L dNTP Mix 1 L，2 mol/L 上下游引物各 1 L，50 mg/L DNA 稀释液 1 L，2.5106U/L Taq DNA Polymerase 0.5 L，用去离子三蒸水补齐
10、至 20 L。PCR 反应条件：预变性 95 5 min，然后 94 变性 40 s、66 退火 40 s、72 延伸 90 s，35 个循环后 72 延伸 10 min。取 5 L PCR 产物经 12 g/L 琼脂糖凝胶电泳，确定扩增片段为所需目的片段。将 PCR 产物纯化，根据 Sanger 双脱氧链终止法原理测序。测序引物分别是 5-GAGTCCTTGGGATGGACACA-3,5-CTTGCCAACCCTCTGCTT-3。 1.3 统计学分析 正态分布计量资料用 xs 表示，数据间比较采用 t 检验及 2 检验。用 Hardy-Weinberg 检验确认标本的群体代表性。采用 PPM
11、S 1.514统计软件进行处理。 2 结果 2.1 两组生化资料的比较 原发性高尿酸血症病人组三酰甘油（TG） 、尿酸、尿素氮（BUN）明显高于正常对照组，差异具有显著性（t=5.63923.210,P0.001） 。见表 1。表 1 正常对照组与病人组生化资料比较（略） 2.2 各 SNP 位点的 Hardy-Weinberg 遗传平衡分析及基因型与原发性高尿酸血症的相关性 对 SNP 位点进行遗传平衡分析显示，正常对照组与病人组标本代表性较好（2=0.170.36,P0.05） 。共检测到 3 种 SNP，分别为 1925 GA、del G 1951 及 G 2174 A，上述 SNP 位
12、点所组成的基因型频率在高尿酸血症病人组和正常对照组差异无显著性（2=2.55、1.33、0.93,OR=1.71、0.84、0.86,P0.05） 。见表2。2 例原发性高尿酸血症病人 hURAT1 基因 3UTR 区第 1827-1828 位 2个碱基缺失（del TC 1827-1828） ，这 2 例病人的血尿酸水平明显高于其他病人，正常对照组未检测到该缺失。表 2 Hardy-Weinberg 遗传平衡、基因型与疾病相关性分析（略） 2.3 两组间单倍型频率比较 本文 3 个 SNP 位点主要形成 5 种单倍型，正常对照组和病人组单倍型频率差异无显著意义（P0.05） 。见表 3。表
13、3 两组单倍型频率比较（略） 3 讨 论 hURAT1 是近年来发现的维持血尿酸水平的关键离子通道，hURAT1 基因的异常表达可直接导致低尿酸或高尿酸血症19 。GRAESSLER 等3研究显示，hURAT1 基因第 2 外显子 C426T 多态性与德国人群肾尿酸排泄减少和高尿酸血症显著相关，相对于 CC 基因型，CT 和 TT 基因型个体肾脏排泄分数明显降低，血尿酸水平明显升高。YUKIO 等4研究显示，日本男性受试者中 hURAT1 第 4 内含子 G/T 多态不同基因型者（GG、GT 和 TT）血尿酸水平明显不同，GG 基因型者血尿酸水平最高，GT基因型者次之，TT 基因型者最低，提出
14、在日本人群中，该 SNP 位点可作为独立的高尿酸血症预测标记。VA ZQUEZ-MELLADO 等5对墨西哥原发性痛风病人及一级家属和 120 名健康个体的 hURAT1 基因序列分析结果显示，69 例原发性痛风病人中 16 例存在 hURAT1 基因突变，占病人的23%，其中 5 种突变位于第 5 外显子，1 种突变位于第 4 外显子，提出上述突变可能与原发性高尿酸血症有关。提示 hURAT1 基因 SNP 或突变与原发性高尿酸血症密切相关。 人类基因的转录翻译是一个相当复杂的过程。 hURAT1 基因 3UTR区 SNP 和基因突变可导致该基因功能的改变，是原发性低尿酸血症发病的重要原因。
15、ANZAI 等6的研究显示，日本人群 hURAT1 基因 3UTR区存在 del GTCCT 1639-1643 rs61157735（-/GCCCT） 多态，该多态导致肾性低尿酸血症。GRAESSLER 等5研究显示，德国原发性高尿酸血症病人 URAT1 基因的 3UTR 存在 1703-1705 位 CCT 碱基的缺失。本研究在正常人群和原发性高尿酸血症病人中均未发现上述多态性位点和碱基缺失, 说明 3UTR 的 SNP 和突变存在种族差异。 本研究结果显示，hURAT1 基因 3UTR 存在 3 个 SNP 位点：1925 GA、del G 1951（rs11287614）及 G 217
16、4 A，和一个突变位点 del TC 1827-1828。其中 1925 GA 和 G 2174 A 是国际上在该区域首次发现的 SNP 位点，虽然这 2 个 SNP 位点在正常人群和原发性高尿酸血症人群中均出现且基因型频率差异无显著性，但由于在其他种族中均未发现该位点的存在，且在中国人群中出现频率较高，提示这 2 个 SNP 位点可能是遗传标记。 本研究显示，3UTR 区尚存在 1827-1828 位 TC 碱基的缺失，由于该缺失只在原发性高尿酸血症病人中出现，在 429 例正常人群中无此缺失，因此该缺失为突变。对突变携带者进一步研究显示，突变携带者血尿酸水平明显高于病人组其他病人，提示 d
17、el TC 1827-1828 可能与原发性高尿酸血症有关。该点突变可能通过下列机制导致高尿酸血症：碱基缺失引起 3UTR 端阅读框架发生改变，转录终止点或剪切位点发生改变；抑制局部 micro RNA 形成，使基因转录活性增强；TC 碱基缺失后，polyA 长度改变，增强 mRNA 稳定性和转录翻译效率。转录翻译后URAT1 基因表达增强，对尿酸的重吸收增多，导致高尿酸血症。由于该点突变只在 2 例原发性高尿酸血症的病人中检出，检出率仅为 0.733%，提示该点突变虽然可能与原发性高尿酸血症有关，但不是导致原发性高尿酸血症的主要原因。 综上所述，中国山东沿海地区人群 hURAT1 基因的 3
18、UTR 存在 3 个SNP 位点，与原发性高尿酸血症的关联不明显，可作为中国山东沿海地区人群正常基因组遗传标记；1827-1828 位 TC 碱基的缺失可能与原发性高尿酸血症相关，需扩大样本量进行筛查，并通过功能实验进一步证实该碱基的缺失是否与 hURAT1 基因的高表达有关。 【参考文献】 1ANZAI N, ENOMOTOB A, ENDOU H. Renal urate handling: clinical relevance of recent advancesJ. Curr Rheumatol Rep, 2005,7:227-234. 2HEDIGER M A, JOHNSON R
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