1、JAK 激酶抑制剂 AG490 联合顺铂对喉癌细胞STAT3 信号转导通路的抑制作用作者：王俊阁 李晓明 路秀英 【摘要】 目的: 探讨 Stat3 信号转导通路在药物治疗喉癌中的作用机制. 方法：应用 JAK 激酶抑制剂 AG490 与顺铂(DDP)处理喉癌细胞系Hep2 细胞，Western Blot 检测 Stat3 信号转导通路成员表达，MTT 法检测细胞增殖状态，流式细胞技术检测细胞周期与凋亡. 结果: AG490与 DDP 可以抑制喉癌细胞增殖，促进喉癌细胞凋亡（P=0.008） ，联合应用 AG490 与 DDP 可以起协同作用，喉癌细胞 Stat3 信号转导通路成员表达与活性明
2、显下降. 结论: JAK 激酶抑制剂 AG490 与 DDP 联合应用可能为治疗喉癌提供了新的理论基础. 【关键词】 喉癌 增殖 凋亡 0 引言 细胞因子的信号传导途径之一 JAK 酪氨酸蛋白激酶(Januskinase, JAK)信号转导子和转录活化子(signal transducers and activators of transcription, Stat)途径是近来研究的热点. 为了研究 Jak/Stat3 的活化与喉癌之间的关系，我们应用 JAK 激酶抑制剂 AG490 与顺铂（diamminedichloroplatinum，DDP）处理喉癌细胞,观察对 Stat3 通路以及喉
3、癌细胞增殖和凋亡的影响，探讨 Stat3 信号转导通路在药物治疗喉癌中的作用. 1 材料和方法 1.1 材料 喉癌细胞系 Hep2 （美国国家癌症研究所病理实验室）培养在含有 100 mL/L 小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)的RPMI 1640 培养基(美国 Gibcobrl 公司)中，于 37, 50 mL/L CO2 饱和湿度条件下培养，实验所用的细胞均处于指数生长期. JAK 激酶抑制剂AG490(美国 Calbiochem 公司),DDP, RPMI 1640 液配制药物溶液,根据量效曲线选定药物浓度. 1.2 方法 研究分组： 对照组； AG490 组； AG490 +
4、DDP组； DDP 组. 溶液中含等量乙醇和 DMSO. 1.2.1 AG490 对细胞生长抑制作用的检测 接种细胞于 96 孔板，每孔接种 100 L 含 1104 个细胞,贴壁后,无血清培养细胞 1624 h，使细胞同步化. 空白对照组加无血清培养基，试验组分别加入 AG490 至终浓度为 30 mg/L，DDP 的终浓度 4 mg/L, AG490+DDP 组加药顺序为先加AG490，于 6 h 后加 DDP，每组设 6 个重复孔. 分别培养至规定时间后，每孔含 150 L 培养液， 0,24,48,72 h 分别加入 5 g/L MTT 100 L（美国 Sigma 公司） ，继续培养
5、 4 h，每孔加入 5 g/L 甲臜 200 L，弃去培养液，每孔加入 150 L DMSO，振荡 10 min，酶标仪测定 A570 nm，重复实验 3 次,绘制生长曲线. 1.2.2 AG490 处理后 Hep2 细胞细胞周期和凋亡率 无血清培养细胞 1624 h，使同步化，试验组分别加入 AG490,至终浓度为 30 mg/L，DDP 的终浓度为 4 mg/L，继续培养，0,24,48,72 h 分别消化细胞，0.01 mol/L PBS 0.5 mL 重悬细胞，冰乙醇固定细胞过夜 ,加入 RNAase A至终浓度 50 mg/L，37恒温水浴 1 h，加入碘化丙啶（Propidium
6、Iodide, PI） （美国 Sigma 公司）至质量浓度 50 mg/L，4避光染色 1 h，流式细胞仪 EpicsXL 型（美国 Becton Coulter 公司）检测, 实验重复 3 次，资料用 Multicycle AV 细胞周期分析软件处理. 同步化处理及单细胞悬液制备同前，应用凋亡检测试剂盒，0.01 mol/L PBS 离心洗涤 2 次，200 L 结合缓冲液重悬，加入溴乙啶至终浓度 1 mg/L，加入PI 至 2.5 mg/L，室温避光染色 15 min，流式细胞仪检测. 1.2.3 Stat3 蛋白及其靶基因产物表达和磷酸化活化的检测 无血清培养细胞 1624 h，使细胞
7、同步化. 空白对照组加无血清培养基，试验组分别加入 AG490 至 30 mg/L，DDP 4 mg/L；分别用胰酶消化收集对照组、AG490 组、AG490 + DDP 组、 DDP 组. 参照美国 Pierce 公司蛋白提取方法，分别抽提胞质、胞核蛋白，用考马斯亮蓝 G250 试剂盒测定蛋白浓度. 取总蛋白 100 g 经 100 g/L 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后电转移到 PVDF 膜上，封闭后，加入 Stat3, pStat3,BclxL 与 CyclinD1 小鼠 mAb（美国 Santa Cruz 公司，抗体稀释度为 170） ，加入二抗体 HRP标记的山羊抗鼠 IgG（抗体稀释度为
8、 11000） ，actin 作为内参照，用 ELC 发光试剂盒（美国 Amersham 公司）检测杂交信号. 用 GelPro凝胶分析软件进行半定量分析. 用表面密度代表条带的面积乘荧光强度，来表示目的蛋白的相对含量. 统计学方法：数据用 xs 表示，采用 SPSS11.0 统计软件进行分析，组间比较采用方差分析及两两比较法进行. 2 结果 2.1 Hep2 细胞增殖活力 Stat3 在喉癌细胞系 Hep2 细胞中持续表达和磷酸化（图 1）. 对照组没有抑制肿瘤细胞的增殖作用，AG490转染后 12 h 开始表现出一定的增殖抑制效应，36 h 表现出明显的抑制效应，细胞活力持续下降(F=5.
9、26, P=0.004)；DDP 组表现出一定的增殖抑制效应；AG490 与 DDP 作用于 Hep2 细胞后,细胞增殖水平下降. AG490+DDP 组与 DDP 组相比差异有统计学意义（F=4.856, P=0.008, 图2）. 2.2 Hep2 细胞周期和凋亡 AG490 与 DDP 作用于喉癌细胞系Hep2 细胞 72 h 后,G1 期细胞比率由 55.5%上升至 70.7%,S 期细胞比率分别由 33.1%下降至 25.7%,细胞增殖受抑制. AG49+DDP 组 70.7%的细胞阻滞于 G0/G1 期，高于 AG490, DDP, 对照组(图 3, P0.05). AG490与
10、DDP 共同作用于 Hep2 细胞 72 h 后，凋亡细胞百分比分别由 2.3%增加至 31.3%. AG490+DDP 组、DDP 组、AG490 组、对照组凋亡率分别为31.3%, 23.5%, 14.1%, 5.1%；统计结果表明，AG490 与 DDP 作用 Hep2细胞后凋亡细胞增多，AG490+DDP 组与对照组相比，差异有统计学意义（F=4.824, P=0.005). 2.3 Stat3 信号转导通路成员活性与表达 AG490 与 DDP 作用于喉癌细胞系 Hep2 细胞 72 h 后, Stat3 蛋白表达与活性下调,其靶基因产物 BclxL 与 CyclinD1 表达下降(
11、图 4). 3 讨论 AG490 是一个人工合成的苯亚甲基的丙二腈的脂类衍生物,其结构类似于酪氨酸,通过和受体酪氨酸激酶竞争结合位点,可以阻断 Jak2 和 Jak3的激活,从而阻断 Janus 酪氨酸激酶信号转导和转录活化因子(Jak/Stat)信号传导1. JAKs/Stats 信号转导通路与细胞的增殖、分化及凋亡关系密切,该通路异常活化可导致细胞异常增殖和恶性转化，Stats 家族重要成员 Stat3 在多种肿瘤组织与细胞系中异常激活并且与肿瘤对治疗的反应密切相关,目前被确认为是癌基因2. 我们就 Stat3 信号转导通路在喉癌发生发展中的调控机制进行了初步研究,结果显示，Stat3 在
12、人喉癌组织与细胞系中异常活化,且与喉癌组织学类型、临床分期等密切相关3. 我们发现，Stat3 通路在喉癌细胞系 Hep2 细胞增殖过程中持续激活，应用 JAKs 特异性抑制剂 AG490 作用于喉癌细胞系 Hep2 细胞，Stat3 蛋白的表达量下降，磷酸化水平也降低，阻断 Stat3 活化可以诱导喉癌细胞凋亡，BclxL 与 cyclinD1 蛋白表达同步下调. 说明 AG490 能够有效抑制 Hep2 细胞中 Stat3 蛋白的表达和活化. AG490 作用于Hep2 细胞后，细胞增殖受到明显抑制. Hep2 细胞增殖水平随 AG490作用时间延长而下降，相应空白对照组变化不明显. 因此
13、 AG490 能够有效地降低 Hep2 细胞中 Stat3 蛋白的表达和活化水平，进而抑制细胞的增殖，促进其凋亡，其机制可能是 AG490 削弱了 Stat3 蛋白的表达和活化，引起一系列与细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡相关基因如 BclxL与 cyclinD1 等的表达紊乱，进而诱导细胞的增殖抑制和凋亡增加. 其他研究结果表明4-6,各种方式阻断 Stat3 信号通路以后，肿瘤细胞中Stat3 下游抗凋亡基因 BclxL 与 cyclinD1 的表达也受到阻断，细胞发生凋亡. 我们应用反义技术在喉癌中阻断 Stat3 信号通路的研究结果也是相符合的7. 本实验结果表明 AG490+DDP 作用
14、于喉癌细胞系 Hep2细胞 72 h 后，喉癌细胞系 Hep2 细胞中 Stat3,pStat3,BclxL 及cyclinD1 表达水平较单纯化疗明显下降，由于喉癌对化疗药物属中低度敏感，表明喉癌细胞耐药可能与 Stat3 异常激活有关, JAK 激酶抑制剂AG490 可以协同化疗药物 DDP 对在喉癌 Hep2 细胞起治疗作用. JAKs 作为上游激酶介导 Stats 信号传导通路活化的机制是：JAK 激酶活化后募集胞浆中以单体存在的 Stats 分子,使与受体结合的 Stat 分子酪氨酸磷酸化后，Stats 形成同源或异源二聚体从受体上释放下来,进入细胞核与特异的 DNA 序列结合启动靶
15、基因转录8. 我们发现BclxL 蛋白表达水平在 AG490 作用后逐渐降低，细胞凋亡明显增加，BclxL 可以抑制多种凋亡诱导因素介导的细胞凋亡. 本实验结果提示AG490 对 Hep2 细胞的促凋亡作用和 JAK2Stat3BclxL 途径有关. 总之, Stat3 信号传导通路在喉癌细胞中的转录调控机制尚不清楚，Stat3 的异常激活与喉癌细胞耐药关系还有待于进一步明确. 【参考文献】 1 Hebenstreit D, HorejsHoeck J,Duschl A. JAK/STAT dependent gene regulation by cytokines J. Drug News
16、Perspect,2005,18(4):243-249. 2 Hodge DR, Hurt EM, Farrar WL.The role of IL6 and STAT3 in inflammation and cancer J. Eur J Cancer, 2005, 41(16):2502-2512. 3 王俊阁,李晓明,陈英会,等. 信号转导子和转录激活因子 3 在喉癌组织中的表达及临床意义J.临床耳鼻咽喉头颈外科杂志，2007,21(3):113-115. 4 Song L, Turkson J, Karras JG, et al. Activation of STAT3 by rec
17、eptor tyrosine kinases and cytokines regulates survival in human nonsmall cell carcinoma cellsJ. Oncogene, 2003, 22(27): 4150-4165. 5 Yu H, Love R. The STATs of cancernew molecular targets come of ageJ. Nat Rev Cancer, 2004, 4(2): 97-105. 6 Kusaba T, Nakayama T, Yamazumi K, et al. Expression of pStat3 in human colorectal adenocarcinoma and adenoma correlation with clinicopathological factorsJ. J Clin Pathol, 2005, 58(8): 833-838. 7 王俊阁,李晓明,陈英会,等. 信号转导子和转录活化因子 3 反义寡核苷酸联合化疗调控喉癌细胞增殖与凋亡的分子机制 J.中华耳鼻咽喉头颈外科杂志, 2007,42(3):222-226.
