1、MPT64 DNA 疫苗对鼠结核分枝杆菌感染的保护作用作者：孙平，骆旭东，朱道银，唐国建 【关键词】 结核分枝杆菌 【Abstract】 AIM: To explore the protective efficacy of the DNA vaccine encoding Mycobacterium tuberculosis MPT64 in mice infected with Mtb. METHODS: C57BL/6 mice were intramuscularly immunized with the DNA vaccines or BCG (i.d.). The mice were
2、 challenged with 106 CFU H37Rv via lateral tail vein 35 d after the third immunization for DNA vaccine groups and 100 d after for BCG vaccinated group. The mice in the vaccinated groups and control groups were sacrificed 42 d after challenge. The lungs and spleens were removed respectively and the n
3、umber of CFU in organs and histopathologic changes were determined. The antibody level, IFN, IL4 and the survival time in all of the mice were evaluated. RESULTS: The antibody titer of pcDNA/MPT64 group was higher than that of other groups (P0.05). Both the level of IFN produced by spleen lymphocyte
4、s and the spleen lymphocyte proliferation from BCG group and pcDNA/MPT64 group were higher than those of other groups (P0.05), and no IL4 was found in all groups. The number of bacterial colonies in the lungs and spleens significantly decreased at 6th week postchallenge in all the vaccinated groups
5、(P0.05), especially in BCG group (P0.01). The pulmonary histopathological changes were observed 6 weeks following challenge with M.tuberculosis H37Rv. In PBS and pcDNA3.1 groups, the lesion was characterized by seroplastic inflammatory infiltration and lung tissue necrosis, and in BCG group by granu
6、lomas and numerous macrophages, lymphocytes and a few epithelioid cells. The lesion in pcDNA/MPT64 groups was characterized by seroplastic inflammatory infiltration and a few macrophages. The results in spleen were similar to those in lungs. The survival time of BCG vaccinated mice after challenge w
7、ith M.tuberculosis H37Rv was longer than that of other groups. The survival time of pcDNA/MPT64 group was longer than that of negative control groups. CONCLUSION: The pcDNA/MPT64 can improve the protective efficacy of immunized mice against M.tuberculosis challenge. 【Keywords】 Mycobacterium tubercul
8、osis; MPT64; DNA vaccine 【摘要】 目的： 研究 MPT64 DNA疫苗对鼠结核杆菌感染的免疫保护效果. 方法： C57BL/6小鼠 36只，随机分为 4 组. A组（PBS） 、B 组（pcDNA3.1） 、C 组（BCG） 、D 组（pcDNA/MPT64） ；分别于胫前肌注射质粒 DNA免疫，70 g/次， 1次/2 wk，共 3次 . 末次免疫后 5 wk用 106 CFU H37Rv经尾静脉攻击，攻击后 6 wk处死小鼠，测血清总 IgG，特异性脾淋巴细胞增殖实验、IFN 及 IL4分泌水平. 作脾、肺组织荷菌量和病理学检查以及观察小鼠存活时间. 结果：MPT
9、64 基因疫苗诱导小鼠特异性 IgG的产生、脾淋巴细胞增殖以及 IFN 的分泌. MPT64 DNA 免疫组肺、脾组织荷菌量，病理学改变和小鼠存活时间明显优于阴性对照组. 结论：MPT64 DNA疫苗在抗结核分枝杆菌(Mtb)感染过程中具有一定免疫保护作用. 【关键词】 结核分枝杆菌； MPT64； DNA 疫苗 0 引言 DNA 疫苗是 20世纪 90年代发展起来的一种崭新的免疫接种技术，是继减毒活疫苗、亚单位疫苗之后的第 3代疫苗，具有免疫效果良好、尤其是能诱导 CTL的形成和性质稳定、生产简便、价格低廉等优点而倍受青睐1,2. MPT64是结核分枝杆菌(Mtb)早期分泌蛋白中免疫保护作用
10、比较确切的抗原成分之一,我们在已经构建 MPT64真核表达质粒并证实能在小鼠体内诱导特异性体液和细胞免疫应答的基础上，进一步研究其在小鼠体内抗 Mtb感染的能力. 1 材料和方法 1.1 材料 Mtb H37Rv标准株(中科院微生物菌种保藏中心)； pcDNA3.1+，pcDNA/MPT64 和 E.coli DH5 由本教研室收藏 ; Endo free质粒抽提试剂盒(Qaigen 公司)； IFN ELISA试剂盒(上海森雄生物公司); 冻干皮内注射用卡介苗（BCG） 、PPD 标准品(成都市生物制品研究所).SPF级雌性 C57BL/6健康小鼠 36只，68 wk，体质量 1822 g(
11、重庆医科大学实验动物中心). 1.2 方法 按说明书抽提质粒 DNA，紫外分光光度计定量. 动物随机分为 4 组，每组 9只. A组（PBS, 100 L） 、B 组（pcDNA3.1, 70 g） 、C 组（BCG） 、D 组（pcDNA/MPT64, 70 g） ；分别于胫前肌注射 75 g/L利多卡因和质粒混合物（14，100 L）. 间隔 2 wk免疫 1次，共 3次. C组于每只小鼠胸壁皮内注射 0.3 mL（相当于 0.1 mg） ，含活菌 1106 CFU. 将经过小鼠体内毒力复苏的 H37Rv转种于改良罗氏培养基上， 37保湿培养 2 wk；自罗氏培养基上刮取生长良好的干菌落用
12、体积分数为 0.0005的吐温生理盐水研磨成 3 mL的菌悬液,每 0.3 mL菌悬液含M.H37Rv 1106 CFU活菌 1 mg. 攻击时间为 BCG接种后 100 d和末次质粒 DNA免疫后 5 wk，于每只小鼠尾静脉注射 0.3 mL菌悬液，实施攻击；攻击后 6 wk各组处死 5只小鼠，测外周血总 IgG，作 PPD特异性脾淋巴细胞增殖实验，测量 IFN,IL4 分泌水平，取肺、脾作荷菌量测定和病理学检查等；余下的 4只小鼠用来观察其自然存活时间(采用 T50法, Scand J Immunol, 1992;36:307). 1.2.1 肺、脾荷菌量及病理学检测无菌手术取左全肺，称取
13、一定量的左肺组织加入经过灭菌的 5 mL组织匀浆器中，加 2 mL灭菌生理盐水，研磨成匀浆；用 40 mL/L硫酸 2 mL中和,摇匀后静置 15 min,以此原液作10倍梯度稀释；选取 3个稀释度的悬液 100 L，分别涂布于 3个经过37复温的改良罗氏培养基上（含 BCG抑制剂 2thiophenecarboxylic acid hydrazide 2 mg/L） ，37保湿培养 4 wk，进行菌落计数，计算每1 g肺组织的荷菌量. 脾组织荷菌量检测同肺组织. 肺、脾病理学检测：取右上肺叶和部分脾组织用 40 g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，分别行抗酸染色和 HE染色. 1.2.2 免疫
14、学评价 ELISA法检测血清特异性抗体. PPD标准品100 L/孔（10 mg/L）包被酶标板，4过夜. 1 g/L 牛血清白蛋白封闭30 min，洗涤后加入不同稀释度的待检血清，二抗为 HRP酶标羊抗鼠IgG，DAB 显色，波长 490 nm测吸光度（A）值. 以正常鼠血清作阴性对照，A 值 0.05以上、A 实验组/A 对照组2.1 为阳性. 特异性淋巴细胞增殖实验. 分别分离各组小鼠的脾淋巴细胞，用含 10 g/L FCS的 RPMI 1640调整细胞密度为 2107/L，活细胞数为 90%以上，200 L/孔加入96孔细胞培养板中，实验组每孔加入 5 L PPD，对照孔不加 PPD，
15、调零孔不加淋巴细胞；37 50 mL/L CO2孵箱培养 68 h后，每孔加入 20 L MTT（5 g/L溶于 PBS，pH 7.2） ，继续培养 4 h后终止培养，1000 r/min离心 10 min，吸弃上清，每孔加入 DMSO 150 L，振荡 10 min，测 A570 nm值，结果用刺激指数（stimulation index，SI）=A 实验组/A对照组表示. IFN 的诱导和测定. 用含 10 g/L FCS的 RPMI 1640调整细胞密度为 5107/L，200 L/孔加入 96孔细胞培养板中，同时每孔加入 5 L PPD，37 50 mL/L CO2孵箱培养 72 h后
16、，每组 5个孔的培养液混合，5000 r/min 离心 5 min，取上清-20 冻存备检. IFN 的含量的检测用 ELISA的方法，以 IFN 的标准品作标准曲线计算 IFN 的含量. 统计学处理: 所有计量资料用 xs表示. 采用 SPSS软件包进行处理，方差不齐时应用秩和检验. 2 结果 2.1 免疫小鼠血清抗 PPD IgGMtb尾静脉攻击后 6 wk pcDNA/MPT64组抗 PPD抗体滴度明显高于其余各组（P0.01, Tab 1）, BCG组抗体滴度增幅不大.表 1小鼠血清抗 PPD抗体、脾淋巴细胞增殖和 IFN 分泌（略） 2.2 免疫小鼠脾淋巴细胞增殖 BCG和 pcDN
17、A/MPT64免疫组小鼠脾淋巴细胞在体外经 PPD刺激后，可引起淋巴细胞显著的增殖反应，其 SI超过PBS组 2倍以上；空质粒免疫组小鼠淋巴细胞增殖不明显，SI 低于1.3(Tab 1). BCG组与 pcDNA/MPT64组间差异有显著性（P0.01）. 2.3 免疫小鼠脾淋巴细胞特异性 IFN 分泌 PBS和空质粒免疫组小鼠IFN 分泌不明显. BCG组与 pcDNA/MPT64组间差异显著(P0.01, Tab 1)； pcDNA/MPT64 和 PBS、空质粒免疫组组间差异显著（P0.05, Tab 1）. 2.4 免疫小鼠肺、脾组织荷菌量 BCG组和 MPT64 DNA疫苗组明显低于
18、对照组（P0.01） ， BCG组低于 MPT64 DNA疫苗组（P0.05, Tab 2）.表 2DNA疫苗对鼠结核分枝杆菌感染的保护效果（略） 2.5 免疫小鼠肺组织病理 Mtb尾静脉攻击后 6 wk小鼠肺组织切片抗酸染色 PBS对照组(Fig 1A)：Mtb 呈多片簇状分布，数目众多. BCG组(Fig 1B)：Mtb 呈零星分布，数目较 PBS和 pcDNA3.1+组(Fig 1C)明显减少. pcDNA/MPT64组(Fig 1D)：Mtb 呈小簇状和散在分布，数目较 PBS和pcDNA3.1+组明显减少，但比 BCG组为多. Mtb感染后 6 wk小鼠肺组织HE染色镜下病理改变：P
19、BS 和 pcDNA3.1+组：肺组织充血、实变，部分肺泡结构消失，可见数量不等的浆液纤维素性渗出液、少量淋巴细胞和巨噬细胞浸润以及明显的坏死灶，未见结核肉芽肿形成. pcDNA3.1+组病变程度比 PBS组稍轻. BCG组：肺少量充血，渗出比 B组轻；肺泡壁轻度肿胀、增厚，可见由上皮样细胞、多核巨细胞和少量淋巴细胞组成的结核肉芽肿，未见坏死灶. pcDNA/MPT64组：可见数量不等的浆液纤维素性渗出液及少量淋巴细胞和巨噬细胞浸润，结核性肉芽的形成不明显. 2.6 动物存活时间观察 200 d各组小鼠 50%死亡的平均时间. BCG组无 1例死亡，PBS 和空质粒组的平均存活时间分别为 59
20、 d和 75 d，MPT64 DNA 疫苗的平均存活时间为 95 d. 3 讨论 目前，结核病仍然是严重威胁人类健康的主要传染病之一. 由于 BCG的免疫效果不稳定，寻找一种比 BCG更有效的抗 Mtb感染的疫苗已经成为当务之急. MPT64是 Mtb的早期培养液蛋白成分之一， Mr 23 000，由mpt64基因编码，ORF 为 687 bp. MPT64仅存在于 Mtb的 H37Rv, H37Ra, Erdman及 BCG的一些亚株如 Tokyo, Moreau, Russian株之中, 而 BCG 的其他亚株 Glaxo, Pasteur, Canadian, Tice, Danish
21、1331和麻风分枝杆菌则缺乏该基因. MPT64是重要的 T细胞抗原，主要诱导特异性 CTL的形成和 IFN 的分泌，也能诱导体液免疫3,4. 在本实验中 H37Rv攻击后 6 wk，免疫小鼠的 PPD特异性抗体较对照组均有不同程度的增加，以 pcDNA/MPT64组最高， BCG组次之. PPD特异性脾淋巴细胞增殖应答和 IFN 分泌水平，BCG 组和 pcDNA/MPT64组显著升高，说明pcDNA/MPT64 DNA疫苗和 BCG一样在小鼠体内诱导了免疫记忆，当再次遇到相同抗原刺激时便激活了更为强烈的细胞和体液免 从肺脾器官荷菌量，组织病理改变和动物存活时间来看，阴性对照组（PBS 和
22、pcDNA 3.1）菌落计数（CFU 和抗酸染色）都较高，肺组织主要病理改变为大量的浆液纤维素性渗出、极少的炎症细胞浸润和不同程度的灶性坏死，动物存活时间最短；脾组织病理表现不典型，多为淋巴细胞增生和组织细胞浸润. 阳性对照组（BCG）荷菌量较低，肺、脾组织都可见到大量的淋巴细胞增生、组织细胞浸润，肺组织还可看到大量类上皮细胞的聚集和结核肉芽肿的形成. pcDNA/MPT64 DNA免疫组荷菌量也较其 PBS和空质粒组明显减低，但是增生性改变没有 BCG组明显. 以上结果提示，MPT64 DNA疫苗对鼠 Mtb感染有明显的保护作用，MPT64 可作为结核病新型疫苗的候选抗原之一. 【参考文献】
23、 1 Doherty TM, Andersen P. Tuberculosis vaccines: Developmental work and the futureJ. Curr Opin Pulm Med, 2000; 6(3): 203-208. 2 Enserink M. Driving a stake into resurgent TBJ. Science, 2001; 293(5528): 234-235. 3 Kamath AT, Feng CG, Macdonald M, et al. Differential protective efficacy of DNA vaccin
24、es expressing secreted proteins of Mycobacterium tuberculosisJ. Infect Immun, 1999; 67:1702-1707. 4 Delogu G, Howard A, Collins FM, et al. DNA Vaccination against tuberculosis: Expression of a ubiquitinconjugated tuberculosis protein enhances antimycobacterial Immunity J. Infect Immun, 2000; 68(6): 3097-3102.
