1、L 型电压门控钙通道 1C 亚基羧基末端肽段真核表达载体的构建和表达【摘要】 目的 构建增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein， EGFP)标记的 L型电压门控钙通道(L-type voltage-gated calcium channels， L-VGCCs) 1C 亚基羧基末端肽段(CT，1587-2169)的真核表达载体，并在 COS-7细胞中表达。方法 采用RT-PCR方法扩增 CT的 cDNA，克隆至真核表达载体 pcDNA3.1；采用 PCR方法扩增标签蛋白 EGFP的 cDNA，克隆至重组体 pcDNA3.1-CT，EGFP 位于
2、CT的羧基末端；采用脂质体转染法将重组体 pcDNA3.1-CT-EGFP转染COS-7细胞，通过荧光显微镜和免疫印迹等方法检测重组体的表达。结果 扩增了 CT和 EGFP的 cDNA；构建的 pcDNA3.1-CT-EGFP真核表达载体经限制性内切酶酶切鉴定及测序分析证实了其序列的正确性；荧光显微镜下转染重组质粒的 COS-7细胞中观察到绿色荧光，免疫印迹分析显示pcDNA3.1-CT-EGFP转染组有明显条带。结论 成功构建 pcDNA3.1-CT-EGFP真核表达载体，并且在 COS-7细胞中得到表达。 【关键词】 L-型电压门控钙通道 1C 亚基 克隆 表达 Abstract:Obje
3、ctive To construct and express in COS-7 cells the enhanced green fluorescent protein (EGFP) tagged carboxyl terminal sequence (CT, 1587-2169) of L-type voltage-gated calcium channel 1C subunits.Methods The CT cDNA was amplified by RT-PCR and cloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.1. EGFP cD
4、NA was amplified by PCR and cloned into pcDNA3.1-CT recombinant. EGFP was tagged to the C-terminus of the full-length CT. The recombinant was transfected to COS-7 cells by the method of lipofection and the protein expression was evaluated by fluorescence microscopy and immunoblot analysis.Results CT
5、 cDNA and EGFP cDNA were cloned. The pcDNA3.1-CT-EGFP recombinant constructed was verified by restriction endonuclease digestion and sequencing. Green fluorescence was shown in COS-7 cells transfected with the recombinant. The immunoblot analysis displayed a distinct band in the pcDNA3.1-CT-EGFP tra
6、nsfected group.Conclusion pcDNA3.1-CT-EGFP recombinant is successfully constructed and can be expressed in COS-7 cells. Key words: L-type voltage-gated calcium channels; 1C subunits; clone; expression 神经元胞内 Ca2+超载是缺血性脑损伤的关键因素，电压门控钙通道(voltage-gated calcium channels, VGCCs)是介导 Ca2+内流的主要方式之一1 。L 型电压门控钙
7、通道(L-VGCCs) 广泛分布于哺乳动物中枢神经系统2-3 ，当神经元细胞膜除极时开放，胞外的钙离子流入胞内，参与胞内钙稳态和神经兴奋性的调控，与突触可塑性4 、基因表达5-6 、激素分泌7等多种神经元生理过程有关。 中枢神经系统 L-VGCCs是由 1、2、 亚基组成的糖基化多肽复合体，2 亚基位于胞外，1 和 亚基为跨膜亚基， 亚基位于胞内。其中 1 亚基是形成离子通道的主要功能亚基，其他亚基主要起调节作用。神经型 L-VGCCs 的 1 亚基主要是 1C 和 1D 亚型8 。1C(Cav1.2)亚基主要分布在海马、纹状体、大脑皮质等对缺血敏感脑区的神经元胞体和近端的树突8 ，其位于胞内
8、的 C端包含多个功能基序和结构域，有 EF手基序(EF hand motif)、1-8-14 基序(1-8-14 motif)、LA 基序(LA motif)、CB 基序(calmodulin-binding motif， CB motif)、C端结合区、富含脯氨酸结构域(proline-rich domain, PRD)和 C端抑制性结构域等，上述基序和结构域通过与其他信号分子相互作用而调控通道的功能1 。本研究构建增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein， EGFP)标记的 1C 亚基羧基末端肽段(含 1587-2169位氨基酸残基，简称 C
9、T)的真核表达载体 pcDNA3.1-CT-EGFP，为进一步研究 1C 亚基在缺血性脑损伤中的作用及机制奠定基础。 1 材料和方法 1.1 载体、菌株和细胞株 质粒 pcDNA3.1(+)购自 Invitrogen公司，pGEM-T 载体购自 Promega公司；大肠杆菌 JM101、COS-7 细胞均为本实验室保存。 1.2 主要试剂 总 RNA提取试剂盒、PCR Master Mix试剂盒、DNA 纯化试剂盒、T4DNA 连接酶、限制性内切酶 EcoR 、Hind 和 Apa 为 Promega公司产品；Takara Ex Taq试剂盒为 Takara公司产品；Lipofectamine
10、 2000和 1kb Plus DNA Ladder为 Invitrogen公司产品；DMEM购自 GIBCO公司；新生牛血清购自杭州四季青生物技术有限公司；鼠抗 EGFP抗体购自 Clontech公司；碱性磷酸酶(AP)标记的羊抗鼠二抗购自 Sigma公司；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 1.3 引物设计 1.3.1 CT cDNA扩增的引物设计 根据 Genbank中的大鼠 1C 的cDNA序列(NM012517)，以 4759-4761位编码甲硫氨酸的 ATG作为扩增序列的起始密码子，以 6507位作为扩增序列结束的位置，设计特异性上下游引物(下划线为酶切序列)： P1:
11、GCCAAGCTTATGTTCAATGCTACACT (Hind )； P2: GAATTCGTTGCTGACATAGGACCTGC (EcoR )。 1.3.2 EGFP cDNA扩增的引物设计 根据 EGFP的 cDNA序列设计特异性上下游引物(下划线为酶切序列)： P3: GAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAG (EcoR )； P4: GGGCCCCTACTTGTACAGCTCGTC (Apa )。 1.4 总 RNA提取和 RT-PCR扩增 CT cDNA SD雄性大鼠(清洁级, 由徐州医学院实验动物中心提供)，RNA 提取试剂盒提取大鼠海马总 RNA。以提取的总 RNA为
12、模板，使用 Takara Ex Taq试剂盒，先以寡聚 T作为引物进行反转录，反应参数为：室温 10 min, 1个循环，42 1 h，1 个循环；冰水中 2 min，1 个循环。然后以 P1和 P2为上下游引物进行PCR，反应参数为：94 4 min，1 个循环； 94 30 s，58 30 s，72 3 min，28 个循环。RT-PCR 产物以 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。 1.5 pcDNA3.1-CT真核表达载体的构建 1%低熔点琼脂糖凝胶电泳、DNA纯化试剂盒回收纯化目的基因片段，然后连入 pGEM-T载体，筛选阳性重组子测序分析，DNA 序列分析委托上海生工生物工程技术服务有限公司进
13、行。 将测序正确的重组子分别经 Hind /EcoR 双酶切，亚克隆至pcDNA3.1载体。转化感受态细胞 JM101，提取的质粒经 Hind /EcoR 双酶切鉴定重组子， 阳性重组子进行序列测定。 1.6 pcDNA3.1-CT-EGFP真核表达载体的构建 以我室构建的pcDNA3.1-EGFP(上、下游的酶切位点均为 EcoR )为模板，使用 PCR Master Mix试剂盒，以 P3和 P4为上下游引物进行 PCR，反应参数为: 94 2 min，1 个循环；94 30 s，60 1 min，72 1 min，35 个循环；72 7 min，1 个循环。RT-PCR 产物以 1%琼脂
14、糖凝胶电泳鉴定。参照 1.5方法连入 pGEM-T载体。 将测序正确的 pcDNA3.1-CT与 pGEM-T-EGFP分别用 EcoR /Apa 进行双酶切，1%低熔点琼脂糖凝胶回收纯化酶切后的 pcDNA3.1-CT和EGFP cDNA，将两者连接，参照 1.5方法转化感受态细胞 JM101，筛选，提取质粒，Hind /EcoR /Apa 三酶切鉴定与测序。 1.7 COS-7细胞培养与质粒转染 COS-7细胞以含 100 ml/L 新生牛血清的 Dulbecco改良培养基(Dulbeccos modified eagle media, DMEM)培养，待细胞密度至 90%95%时，以脂质
15、体转染法(Lipofectamine 2000)将重组质粒 pcDNA3.1-CT-EGFP及空质粒 pcDNA3.1分别转染入 COS-7细胞中，用荧光显微镜观察荧光情况，36 h后收集细胞，超声破碎，以改良 Lowry法测定蛋白质浓度。 1.8 免疫印迹 蛋白质样品(100 g)经 7.5% SDS-PAGE分离，电转至硝酸纤维素膜(NC 膜)上。NC 膜在含 3% BSA的封闭液中室温孵育 3 h后，鼠抗 EGFP抗体 4孵育过夜，AP 标记的二抗室温孵育 2 h，NBT/BCIP 中显色，扫描膜上显色条带。 2 结 果 2.1 CT cDNA的扩增 根据 1C 的 cDNA序列(Gen
16、bank， NM012517)，以大鼠海马总 RNA为模板，用设计的特异性引物进行 CT cDNA的扩增。琼脂糖凝胶电泳显示，扩增出的 cDNA与目的基因片段大小(1749 bp) 相符(图 1)。 图 1 RT-PCR产物电泳图 M. DNA Marker; CT. RT-PCR产物 2.2 pcDNA3.1-CT真核表达载体的构建与鉴定 阳性重组子 pGEM-T-CT测序分析结果显示，CT cDNA序列与 Genbank NM012517中 4 759-6 507序列相比，有 2个核苷酸不同(5877 和 5934)，属于单核苷酸多态性位点，但表达的多肽氨基酸序列是完全一致的。将测序正确的
17、 pGEM-T-CT重组子用 Hind /EcoR 双酶切，回收目的片段，与经同样双酶切的pcDNA3.1载体连接。琼脂糖凝胶电泳显示，筛选出的阳性重组子经 Hind /EcoR 双酶切后有 2条 DNA条带，其大小分别与载体 pcDNA3.1 (5400 bp) 和 CT cDNA(1749 bp)一致(图 2)，且测序结果正确。结果表明 CT的 cDNA已成功克隆至 pcDNA3.1真核表达载体。 2.3 pcDNA3.1-CT-EGFP真核表达载体的构建 将扩增的 EGFP cDNA(结果未显示)连入 pGEM-T载体，筛选阳性重组子，将测序正确的pcDNA3.1-CT与 pGEM-T-
18、EGFP分别用 EcoR /Apa 进行双酶切，1%低熔点琼脂糖凝胶回收纯化酶切后的 pcDNA3.1-CT和 EGFP cDNA，将两者连接。琼脂糖凝胶电泳显示，筛选出的阳性重组子经 Hind /EcoR /Apa 三酶切后有 3条 DNA条带，其大小分别与载体 pcDNA3.1(5400 bp)、CT cDNA(1749 bp)和 EGFP cDNA(720 bp)相一致(图 3)，且测序结果正确。 图 2 pcDNA3.1-CT 的双酶切产物电泳图 M. DNA Marker; CT. pcDNA3.1-CT Hind /EcoR 双酶切产物 图 3 pcDNA3.1-CT-EGFP的三
19、酶切产物电泳图 M. DNA Marker; CE. pcDNA3.1-CT-EGFP Hind /EcoR /Apa 三酶切产物 2.4 真核表达载体在 COS-7细胞中的表达 将 pcDNA3.1和pcDNA3.1-CT-EGFP分别以脂质体介导法转染 COS-7细胞，荧光显微镜下，pcDNA3.1-CT-EGFP转染组 24 h后开始呈现明显绿色荧光，并不断加强(结果未显示)。36 h后收集未转染组和转染组 COS-7细胞，样品经 SDS-PAGE分离后，以鼠抗 EGFP抗体进行免疫印迹分析。结果显示，pcDNA3.1-CT-EGFP转染组可检测到明显电泳条带(图 4)。以上结果表明，构
20、建的 EGFP融合的 CT真核表达载体在 COS-7细胞中得到了高效表达。 图 4 未转染组和转染组 COS-7细胞 免疫印迹分析图 1.COS-7； 2.pcDNA3.1； 3.pcDNA3.1-CT-EGFP 3 讨 论 短暂性全脑缺血可诱发一系列病理性反应，最终导致海马、皮质等敏感性脑区的神经元损伤。L-VGCCs 通过介导 Ca2+内流，在短暂性全脑缺血及再灌注的信号转导过程中扮演着重要的角色1,9-10 。1C 亚基作为神经型 L-VGCCs的主要功能亚基，通过膜内疏水的 C端所包含的多个功能结构域与其他信号分子相互作用而调控通道功能1 。针对其信号转导机制进行深入研究，有可能发现新
21、的缺血性脑损伤的治疗药物。 本实验以海马中总 RNA为模板，设计 CT的特异性上下游引物，通过RT-PCR方法较灵敏和特异性地扩增到目的片段。测序分析结果表明，目的序列中存在着 2个单核苷酸多态性位点。在 CT cDNA羧基末端插入EGFP cDNA，构建 EGFP融合的 CT真核表达载体，为观察蛋白表达情况提供了重要的依据。EGFP 融合的 CT真核表达载体的成功构建和表达，为我们进一步在体内外研究 1C 亚基的生物学功能及调节机制奠定了基础。【参考文献】 1 侯筱宇, 张光毅. 中枢神经系统 L-型电压门控钙通道的功能调控与脑缺血J.生理科学进展, 2004, 35(1): 77-80.
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