1、MDP 阿霉素脂质体对裸鼠 SOSP M 成骨肉瘤肺转移的治疗作者：屈小鹏，吴道澄，陈军，张殿忠，卫建民，吴红，马保安 【摘要】 目的： 建立人成骨肉瘤高转移细胞亚群 SOSPM 裸鼠肺转移模型，用亚锡亚甲基二磷酸盐 阿霉素脂质体（MDPLADM ）进行治疗并观察其疗效. 方法： 建立 SOSPM 成骨肉瘤裸鼠肺转移模型，制备 MDPLADM ，经尾静脉注入裸鼠体内，观察其抑瘤作用. 应用高效液相色谱法检测裸鼠肺内阿霉素（ADM）的含量. 结果： MDPLADM 对裸鼠肺转移模型具有明显的抑瘤作用，其抑瘤率为 40.0%（P0.05）. 肺湿质量的减轻率为 21.6%（P0.05）. 裸鼠肺内
2、 ADM 含量 MDPLADM 组高于 LADM 组（P0.05）和 ADM 组（P0.05）. 结论： MDPLADM能明显提高 ADM 对 SOSPM 成骨肉瘤裸鼠肺转移模型的抑瘤作用. 【关键词】 多柔比星；脂质体；骨肉瘤；肺肿瘤/继发性；抗肿瘤药 【Abstract】 AIM: To observe the therapeutic efficacy of MDPliposome adriamycin on the pulmonary metastatic model in nude mice carrying human SOSPM osteosarcoma. METHODS: The
3、 pulmonary metastatic model was made in nude mice carrying human SOSPM osteosarcoma. MDPliposome adriamycin was prepared. The antitumor effect of MDPliposome adriamycin was observed and the content of adriamycin in lungs was determined by highperformance liquid chromatography with luorescence detect
4、or. RESULTS: MDPliposome adriamycin exerted obvious antitumor effect on the animal models, with the inhibition rate as 40% (P0.05), and the reduction rate of lung wet weight was 21.6% (P0.05). The content of adriamycin in lungs was higher in MDPliposome adriamycin group than in adriamycin liposome g
5、roup (P0.05) and adriamycin group (P0.05). CONCLUSION: MDPliposome adriamycin improves the antitumor effect of adriamycin for the pulmonary metastasis in nude mice carrying human SOSPM osteosarcoma. 【Keywords】doxorubicin; liposomes; osteosarcoma; lung neoplasms/secondary; antineoplastic agents 0 引言
6、肺转移是骨肿瘤患者死亡的主要原因之一，目前对其的主要治疗是手术加化疗1. 阿霉素（adriamycin, ADM）是有效抗肿瘤药物，其脂质体对于网状内皮系统的治疗效果已得到证实，但其靶向治疗在临床实际应用上具有局限性. 亚锡亚甲基二磷酸盐（methylene diphosphonate, MDP）是一种亲骨性药物，与阿霉素脂质体(liposome adriamycin, LADM)交联后通过改变其在体内的药代动力学分布，可提高骨肿瘤的抗瘤效果. 我们观察 MDPLADM 对 SOSPM 成骨肉瘤裸鼠肺转移模型的治疗作用，为临床骨肿瘤肺转移治疗提供理论和实验依据. 1 材料和方法 1.1 材料
7、Balb/cun/un 裸小鼠 60 只（购自第四军医大学实验动物中心） ，鼠龄 46 wk，体质量 1518 g，雌雄各半，在 SPF 环境下饲养，试验前检疫观察，生长良好. 人成骨肉瘤高转移细胞亚群 SOSPM 由本实验室建立，其肺转移率为 100%2-3 ，在含 100 mL/L 小牛血清的RPMI1640 完全培养液中 37 CO2 孵箱培养. 盐酸 ADM 和 ADM 标准品均购自浙江海正药业股份有限公司；MDP 购自江苏原子医学研究所；倒置及透射显微镜均由日本 Olympus 公司制造；Shimadzu LC6H 型高效液相色谱系统，配 RF 紫外检测器，CR3A 数据处理仪，均购
8、自日本岛津公司. 1.2 方法采用常规细胞培养方法，复苏 SOSPM 细胞，取对数生长期细胞，经 25 g/L 胰酶消化后制成细胞悬液，由尾静脉注入裸鼠体内，每只注射 0.2 mL（2.5109/mL 细胞密度）. 2 wk 后重复注射 1 次. 6 wk后挑选出确有肺转移的裸鼠 55 只，用高效液相色谱法检测其中 9 只肺内ADM 含量，其余 46 只裸鼠随机分为 5 组： MDPLADM 组，LADM 组，游离ADM 组，MDP 组和生理盐水组（对照组） ，各组裸鼠数分别为9，10，8，10 和 9 只. 各组裸鼠均由尾静脉给药. MDPLADM 组, LADM组和 ADM 组均按 5 m
9、g/kg 给予 ADM, MDP 组按 2.5 mg/kg 给予 MDP，对照组按 5 mg/kg 给于生理盐水，每隔 72 h 治疗 1 次，共治疗 3 次. 治疗 9 d 后脱臼处死裸鼠， 750 mL/L 乙醇消毒，摘取双肺 . 将 9 只行高效液相色谱法检测的裸鼠随机分为 ADM 组，LADM 组和 MDPLADM3 组，每组 3 只，给药量及治疗方式同前. 治疗后 9 d 处死裸鼠，取出双肺，电子天平称质量，置 5 倍放大镜下见转移灶者计双肺表面结节数，计算抑瘤率 R（%）=（1对照组结节数/治疗组结节数）100%. 100 g/L甲醛溶液固定，脱水后石蜡包埋，切片，HE 染色，光镜
10、下进行组织形态学观察. 完整提取肺脏后加磷酸盐缓冲液（pH=7.8）2.0 mL，用超生组织匀浆机以 6000 r/min 匀浆. 再加氯仿 甲醇混合液(41)5 mL，在液体快速混合器上旋振 5 min，3000 r/min 离心 10 min. 取氯仿层，37氮气吹干. 残渣用甲醇 100 L 溶解，微量过滤器过滤后进样 40 L，测定肺组织标准色谱图，比较各组肺内 ADM 含量. 统计学处理： 采用单因素方差分析与两两比较对各组数据进行处理，MDPLADM 与游离 ADM 两组间用 t 检验. 高效液相色谱法检测三组裸鼠肺内 ADM 含量后，检测值以 MCPKP 程序采用非线性最小二乘法
11、自动拟合求得. 2 结果 2.1MDPLADM 对裸鼠肺转移瘤的抑制作用各组裸鼠肺转移结节数目和大小不同，最大有黄豆粒大，最小需借助 5 倍显微镜观察. 其中MDPLADM 组肺转移结节最少且小，其抑瘤率为 40.0%；LADM 组与游离ADM 组抑瘤率分别为 31.7%和 16.0%. 前者与后者相比较差异具有统计学意义. MDPLADM 组肺湿重减轻率为 21.6%（P=0.024） ，肺湿重减轻率LADM 组及游离 ADM 组分别为 14.3%和 7.4%，前者与后者相比差异具有统计学意义（P0.05，表 1）. 2.2 组织形态学生理盐水对照组肿瘤细胞生长活跃，呈圆形或卵圆形，排列紧密
12、，核大深染数目增多，偶见瘤巨细胞，核膜清晰，核浆比例倒置. 肺泡壁增厚，有充血和渗出，肺泡结构破坏血管淤血，并可见散在大小不等的转移肿瘤细胞团块，团块胞膜清晰与肺组织界线清楚(图 1)，转移瘤切片可见软骨细胞. MDP 组肺部变化和肿瘤细胞生长情况与生理盐水组无明显区别. 游离 ADM 组部分肿瘤细胞结构模糊，部分核溶解，可见核膜收缩. MDPLADM 组肺组织小部分结构破坏，血管淤血及肺泡壁增厚，肿瘤细胞团块区呈大片状嗜酸性坏死(图 2). 表 1MDPLADM 对裸鼠肺转移瘤的抑瘤作用和肺湿重的减轻率 2.3 裸鼠肺内 ADM 的含量以 Y 为 ADM 与外标峰面积之比，以 X 为 ADM
13、的浓度，采用外标法求得肺组织中 ADM 的回归方程为：Y=1.982X-0.476 (r=0.998, n=3). 肺组织中 ADM 浓度在 0.034.20 mg/L，范围内线性良好. 在 S/N=3 时，求得 ADM 的最低检出浓度为 15 g/L，肺组织中 ADM平均回收率为 98.6%，RSD 为 3.1%. 3 讨论 骨肉瘤是恶性程度很高的肿瘤，肺转移是其死亡的主要原因之一. 过去多采用预防性肺部放疗以预防肺转移. 近 20 余年来随着大剂量化疗的应用、免疫治疗的进步和外科技术的日益成熟及推广，成骨肉瘤的治疗取得了很大进展4. 骨肉瘤肺转移灶采用手术切除并辅以化疗，使无瘤成活率明显提
14、高，国外已有 5 a 成活率达 70%的报道. 国内也有学者认为手术+化疗可能使肺转移患者有机会获得根治. 但化疗药物在体内分布广泛，缺乏对肿瘤组织的靶向性，在杀伤肿瘤细胞的同时也伤害宿主正常细胞，产生明显毒副反应. ADM 抗瘤谱广、疗效好，可治疗多种肿瘤，也是最先被普遍认为具有抗骨肉瘤活性的药物5. 但在临床应用中易出现严重的心肌损害、骨髓抑制等副作用. 为了明显减轻化疗药物的毒副作用，增加化疗药物抗肿瘤的疗效，近年来国内外在利用药物导向治疗来减轻药物毒副作用方面进行了一系列的研究. 目前研究较为成熟的脂质体，能明显降低化疗药物的毒副作用，增加抗瘤疗效，已在临床上应用6. Vaage 等7
15、用聚乙烯乙二醇脂质体 ADM 与游离 ADM 治疗人腺管肉瘤（AsP1 ）移植物裸鼠的研究表明，其肿瘤部位的 ADM 浓度，聚乙烯乙二醇脂质体比游离 ADM 组高出 6 倍以上，并显示出明显的抑瘤效果，裸鼠的存活期明显延长. 文艺等8用 MDPLADM 与游离 ADM 对照治疗但由于脂质体对于网状内皮系统的肿瘤具有靶向性以及其本身的胶体结构性质，限制了脂质体对非网状内皮系统肿瘤（如骨肿瘤、胃癌等）的靶向性和疗效，由此引出 MDPLADM 治疗骨肿瘤,以 mAb 为“导向弹头”治疗胃癌等一系列特异性 LADM. 特异性脂质体的开发，使脂质体具有明显的缓释和控释作用以及良好的定向疗效. 肿瘤药物脂
16、质体治疗骨肿瘤肺转移国内外未见报道. 我们利用 MDP 的天然亲骨性，将其与 LADM 直接交联，制备成亲骨性的 MDPLADM ，用于对人成骨肉瘤裸鼠肺转移模型的治疗，结果表明 MDPLADM 对人成骨肉瘤裸鼠肺转移瘤具有明显的抑瘤作用，其抑瘤作用强于 LADM 组（P0.05）及游离 ADM 组（P0.05） ；肺湿重的减轻率低于 LADM 组（P0.05）及游离 ADM组（P0.05）. 综上所述，MDPLADM 应用于人 SOSPM 成骨肉瘤裸鼠肺转移瘤的治疗，具有明确的靶向抗瘤作用，为临床骨性恶性肿瘤的肺转移治疗提供了理论和实验依据. 【参考文献】 1 陆裕朴，胥少汀，葛宝丰，等.
17、实用骨科学M. 北京：人民军医出版社, 1991: 1477. 2 杨宁，范清宇，殷剑宁，等. 完整瘤组织块原位移植法建立人成骨肉瘤转移模型J. 癌症, 2000, 19: 843-846. 3 殷剑宁，范清宇，龙华，等. 高转移性人成骨肉瘤细胞亚群的筛选及生物学特性的观察J. 中华骨科杂志, 1999,19（7）: 437-440. 4 郭卫，李大森，沈丹华，等. 多中心成骨肉瘤的治疗J. 中华骨科杂志, 2006, 26（6）: 376-380. 5 Tunn PU, Reichardt P. Chemotherapy for osteosarcoma without highdose m
18、ethotrexate: A 12year followup on 53 patientsJ. Onkologie, 2007, 30(5):228-232. 6 Hoving S, Seynhaeve AL, van Tiel ST, et al. Addition of lowdose tumor necrosis factoralpha to systemic treatment with STEALTH liposomal doxorubicin (Doxil) improved antitumor activity in osteosarcomabearing ratsJ. Anti
19、cancer Drugs, 2005, 16(6):667-674. 7 Vaage J, Donovan D, Uster P. Tumor uptake of doxorubicin in ployethylene glycolcoated liposomes and therapeutic effect against a xenografted human pancreatic carcinomaJ. Br J Cancer, 1997,75(4): 482-486. 8文艺，马保安，吴道澄，等. MDP 阿霉素脂质体的制备及其对大鼠成骨肉瘤的抗瘤作用J. 第四军医大学学报, 1999, 20（12）: 120-122.
