1、Monascus ruber 5031 洛伐他汀合成酶基因的 PCR 分析【关键词】 洛伐他汀合成酶合成酶 摘要:目的 分析 Monascus ruber 5031洛伐他汀合成酶基因的结构。方法 用 3对以土曲霉洛伐他汀合成酶基因为基础设计的 PCR引物对红曲霉基因组进行了 PCR分析，其中一对引物序列为，正向：5TTC GAT GCG GCC TTC TTC AAT3和反向 5ATG GTT CGG CAT CGT AAT TCC 3 。结果 在红曲霉基因组中相当于土曲霉洛伐他汀合成酶基因的 LNKS区域扩增出了 745 bp的核酸片段，其序列与土曲霉合成酶的这一区域序列相同。结论 土曲霉和
2、红曲霉洛伐他汀合成酶基因存在同源区域。 关键词:红曲霉平；土曲霉；洛伐他汀合成酶合成酶；PCR Abstract: Objective Analyses the structure of Monascus ruber 5031 lovastatin biosynthesis gene cluster. Methods Three pairs of degenerate PCR primers were designed matching the regions of lovastatin biosynthesis gene cluster in Aspergillus terreus,one
3、of them is,5primer: TTC GAT GCG GCC TTC TTC AAT,3primer: ATG GTT CGG CAT CGT AAT TCC. Results A 745bp DNA sequence was amplified by PCR from Monascus ruber 5031 genomic DNA and the sequence is the same with Aspergillus terreus lovastatin biosynthesis gene. Conclusion There is similar sequence within
4、 the lovastatin biosynthesis gene cluster of Aspergillus terreus and Monascus Ruber. Key words:Monascus ruber；Aspergillus terreus；lovastatin biosynthesis gene cluster; PCR 红曲霉（Monascus ruber ）中产生的莫那可林 K（monacolin K）即洛伐他汀(lovastatin)，是胆固醇生物合成中的关键酶 HMGCoA还原酶的竞争性抑制剂，是目前治疗高血脂症最有效的药物之一，并且对心绞痛患者和心肌梗死患者也有一
5、定的治疗效果1 。此外，它还可下调炎症相关转录因子的表达,从而有益于治疗动脉粥样硬化症2 。近期研究表明,它可促进恶性甲状腺细胞凋亡3 ，具有抑制乳腺癌细胞增殖的功能4 。 对参与洛伐他汀生物合成的聚酮合成酶的研究主要在土曲霉中进行5-7 ，土曲霉也是目前工业化生产洛伐他汀的主要菌种。Reeves 和Vederas等研究了土曲霉（Aspergillus terreus）洛伐他汀的 PKS基因结构，序列分析发现在克隆的 64 kb DNA中有 18个开放读框（ORF） ，经序列对比分析确定了 13个 ORF的功能。其基因簇可分为洛伐他汀结构中九酮部分的合成酶基因（即 LNKS）和二酮部分的合成酶
6、基因（即 LDKS） ，LNKS也称为 lovB，而 LDKS含有的功能域有：lovC（烯酯酰还原酶） 、lovD（转脂酶） 、ORF8（HMGCoA 还原酶） 、lovE（调节蛋白） 、lovF（聚酮合成酶） 、ORF13（调节蛋白）及细胞色素 P450 加单氧酶等。 红曲霉中与合成洛伐他汀相关基因的结构的研究则较少，Chen 等8于 2005年 8月发往 Genebank的丛毛红曲霉的莫那可林 K合成酶基因簇是第一个被发现的红曲霉合成洛伐他汀相关酶的基因簇。由于红曲霉中可产生洛伐他汀及多种有生理活性的物质，它又是传统的食品添加剂，所以通过分析研究红曲霉中洛伐他汀合成相关基因将有利于更好地开
7、发利用红曲霉。本文分别以土曲霉的 LNKS基因的 KS区域（位于 lovB基因区域内） 、土曲 LDKS基因簇中的 lovC（烯酯酰还原酶功能域）及lovE（调控蛋白功能域）基因为靶标设计了 3对 PCR引物，以这 3组引物对产洛伐他汀的红色红曲霉菌的基因组 DNA进行了 PCR分析。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株和培养基 红曲菌种：中国工业微生物菌种保藏中心红色红曲霉 Monascus ruber 5031。 斜面培养基：取 50 g大米，洗净加水 800 mL，煮成稀粥，冷却到6065 。将 150 g麦芽粉掺入大米粥中搅拌均匀，放入 5560 保温箱内糖化 4 h，取出
8、过滤。取 250 mL加 250 mL水，加 2%的琼脂，装瓶、灭菌。 菌丝生长培养基：以上培养基不加琼脂。 1.1.2 仪器与试剂 日立高速冷冻离心机。Monacolin K 标准品，购自 Sigma公司。PCR引物由上海生工合成。Taq 酶采用上海生工的 Taq Plus。上海生工的胶回收试剂盒 UNIQ-10。TaKaRa 公司的 pMD-18T克隆载体。 1.2 方法 1.2.1 培养方法 用 2 mL无菌水冲洗孢子，接入固体斜面培养。 固体斜面培养 7 d后，以 5 mL水洗下，稀释至浓度为 107个/mL，取 2 mL加入 100 mL菌丝生长培养基，培养温度 28 ，转速 150
9、 r/min。培养 4 d。 1.2.2 红曲基因组 DNA的提取 根据文献9的方法改进而成。取 1 g菌丝，液氮中磨成粉状，加入 5 mL 2CTAB缓冲液100 mmol/L trisCl (pH 8.0),20 mmol/L EDTA,1.4 mol/L NaCl,2%()CTAB,2%() 巯基乙醇 ，58 1 h，冷至室温后加入等体积氯仿异戊醇（241）抽提，10 000 g离心 10 min，取上清，加入 0.1倍体积 10% CTAB0.7 mol/L NaCl溶液，温和摇动，再加入等体积氯仿异戊醇（241）抽提，10 000 g离心 10 min，取上清，加入 2/3体积预冷异
10、丙醇沉淀 DNA，1 000 g离心 15 min，沉淀溶于 100 L TE 中，加入 RnaseA至终质量浓度 100 g/mL，37 作用2 h，加入等体积酚氯仿（11）抽提，10 000 g离心 10 min，上清中加入 2倍体积无水乙醇沉淀 DNA，沉淀用 70%乙醇洗 1遍，风干，溶于TE，4 保存。 1.2.3 PCR 引物的设计 3 对 PCR引物的设计详见表 1。表 1 PCR引物的设计（略） 第 1组引物是参照 Thomas等10针对土曲霉的 lovB基因的 KS功能域序列设计的引物设计的。 1.2.4 PCR 反应 反应体系：200 mol/L dNTPs,1 U Taq
11、酶，2.625 mmol/L MgCl2,2 mol/L MgSO4,10 mmol/L KCl,10 mmol/L (NH4)2SO4,20 mmol/L TrisHCl(pH 8.75),0.1% Tritonx100,0.1 mg/mL BSA,模板 40 ng（基因组 DNA和 cDNA）,引物 60 ng，总反应体积 20 L。热循环条件：94 预变性 5 min，之后以 94 1 min，50 1 min，72 2 min程序 45个循环，延伸 72 10 min。 1.2.5 lovB 扩增片段的克隆与测序 回收及克隆红曲的 lovB引物扩增产物中约 750 bp的片段，其中连接
12、反应液成分为 pMD18T载体 1 L，PCR 产物 4.5 L，含 T4连接酶和连接酶缓冲液的 solution5 L，在 16 连接 2 h。大肠杆菌 DH5感受态的制备及转化均按分子克隆指南方法操作。克隆的片段交由TaRaKa公司完成测序。 2 结 果 2.1 以基因组 DNA进行扩增反应的结果,见图 1。 图 1表明第 1组引物对 lovB的扩增得到了预期的产物(745 bp)，而第 2组和第 3组引物对 lovC和 lovE的扩增均未得到预计的产物。 2.2 lovB 扩增片段测序结果 回收约 745 bp的片段，并进行测序。经与土曲霉洛伐他汀合成酶基因对比，序列完全相同，序列如下，
13、其中阴影部分是引物序列。 3 讨 论 3.1 lovB 相关的第一组引物的设计及结果分析 第 1组引物参考了 Thomas等10针对土曲霉 lovB（长度约 11 kb）中 KS功能域设计的引物，Thomas 等在设计引物的过程中参考了土曲霉产生洛伐他汀酶基因序列及其他真菌的聚酮合成酶基因和真菌的脂肪酸合成酶基因，使其不易扩增出其他相似功能的基因。其原设计的引物为正向 5TTT CAT GCI GCI TTT TTT AA3；反向 5ATG ATT IGG CAT ICT IAT TCC 3。本文根据这两段引物及土曲霉 lovB基因相关序列设计出第 1组引物。从测序结果来看，表明本文中所用的红
14、色红曲霉基因组中有与土曲霉 lovB中相关序列一致的 745 bp的序列，它很可能就是红色红曲霉中洛伐他汀合成酶基因簇中的一部分。 3.2 lovC相关的第 2组引物的设计和 lovE相关的第 3组引物的设计 土曲霉洛伐他汀合成酶基因中的 LDKS长度约为 43 kb，含有 lovC和 lovE等功能域。 第 2组和第 3组引物是以 primer 3程序根据土曲霉洛伐他汀合成酶基因 lovC和 lovE设计的引物，在设计过程中避开了内含子。但在本实验中未得到预期扩增片段，可见在红色红曲霉和土曲霉中的这 2个基因差异较大。 3.3 3组引物与新发现的丛毛红曲霉的洛伐他汀合成酶基因簇8的电子 PC
15、R分析 从丛毛红曲霉中得到的洛伐他汀基因簇长度约 45 kb，Genebank 序列号为 DQ176595，含有 mkAmkI等 9个功能域，其中 mkA和 mkB是聚酮合成酶功能域，其他功能域与 LDKS类似，但不含烯酯酰还原酶功能域。3组引物都未能从找到匹配序列，也即没有扩增产物。 洛伐他汀生物合成过程复杂，其合成酶基因簇庞大，不同红曲霉洛伐他汀合成酶基因有较大的差异，本文 PCR扩增的片断可作为克隆Monascus ruber 5031洛伐他汀合成酶基因的探针。 参考文献: 1AUER J,EBER B. A clinical focus on statinsJ. Curr Opin I
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