1、mTOR 信号通路与肿瘤的研究进展【摘要】 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，在细胞生长、增殖、分化、细胞周期调控等多个方面起到重要作用。近年来发现 mTOR相关的信号通路复杂且涉及面广泛，其中多个元素的调控异常都与肿瘤的发生密切相关。mTOR 抑制剂能够抑制由于该信号通路异常引起的癌基因的转化、肿瘤的生长和肿瘤血管生成。到目前为止，4 种 mTOR抑制剂被有效地应用于临床，有的已进入、期临床试验。因此，对 mTOR信号通路的深入研究对肿瘤的靶向性治疗具有重要意义。 【关键词】 mTOR 信号通路；雷帕霉素
2、；mTOR 抑制剂；肿瘤治疗ChinaABSTRACT: Mammalian target of rapamycin (mTOR) is a serine/threonine protein kinase that is centrally involved in the control of cell growth, proliferation, differentiation and cell cycle regulation. Recent studies have found that the mTOR pathway is complicated and the dysregulat
3、ion of mTOR pathway is recognized to be associated with lots of tumors. Several inhibitors of mTOR could inhibit oncogene transformation, growth and angiogenesis of tumors. So far, four inhibitors of mTOR have been tested in clinical trials, and some have been accessed to phase or trial. Therefore,
4、in this review, we discuss the regulators that govern mTOR pathway activity, and highlight clinical results obtained with the first generation of mTOR inhibitors to reach the oncology clinics.KEY WORDS: mTOR signaling pathway; rapamycin; mTOR inhibitor; tumor therapy哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of r
5、apamycin, mTOR)是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，从酵母到哺乳动物其广泛存在，且进化十分保守。mTOR 是 1991年 HEITMAN等在分析不同啤酒酵母突变体对雷帕霉素抵抗作用的差别时发现的1。mTOR 属于磷脂酰肌醇 3-激酶相关激酶(phosphatidylinositol 3-kinase-related kinase, PIKK)蛋白家族，在调节细胞生长、增殖、调控细胞周期等多个方面起到重要作用。目前发现 mTOR信号通路的过度活化与肿瘤的发生、发展密切相关，是肿瘤治疗的一个重要靶点。因此本文就 mTOR信号通路与肿瘤的关系及治疗作一综述。1 mTOR 的结构1.1 mTOR
6、的分子结构 人的 mTOR基因位于 1p36.2上，其 mRNA翻译后的蛋白质有 2549个氨基酸残基，其分子结构复杂，分子质量为 289ku。mTOR 的结构域从氨基端到羧基端依次为 HEAT重复序列(即 Huntignton、EF3、PP2A 一个亚基、TOR1)、FAT 结构域、FRB 激酶结构域、NRD 及 FATC结构域(图 1)。mTOR的 N端有 20个重复的 HEAT序列，每个 HEAT大约由 40个氨基酸残基组成 2个 螺旋，每个 螺旋都有一个亲水基团和一个疏水基团。这些重复的 HEAT模体介导了蛋白质间的相互作用2。靠近 mTOR的 C端有一个激酶结构域，约 234个氨基酸
7、残基，其结构和磷脂酰肌醇 3-激酶(PI3K)的催化域相似，是 mTOR属于 PI3K蛋白激酶类家族的重要原因之一。紧挨着激酶结构域上游的是 FRB(FKBP12-rapamycin binding)结构域，它是 FKBP12-rapamycin复合物的结合位点，在雷帕霉素特异性抑制 mTOR中起着连接作用：雷帕霉素可与细胞内的受体 FKBP12结合形成 FKBP-rapamycin复合物，再与 mTOR的 FRB区相结合，从而抑制 mTOR的激酶活性3。FRB 激酶结构域的上游是一个相对较大的 FAT(focal adhesion targeting domain)结构域，约 568个氨基酸
8、残基，同样在 mTOR的 C端最后也有一个 FAT结构域，即 FATC(focal adhesion targeting domain of C-ternimal)结构域。它们在空间上形成特殊的构象以暴露出 mTOR的激酶结构域区。FATC 结构域在 mTOR活性稳定上起着关键的作用，研究表明该结构域内一个氨基酸的缺失都能使 mTOR活性丧失4。NRD(negative regulatory domain)结构域位于激酶催化域和 FATC结构域中间，是 mTOR负性调节域。1.2 mTOR 的存在形式 mTOR 在生物体以两种复合物的形式存在，即 mTORC1及mTORC2。mTORC1 包括
9、 mTOR、mLST8(mammalian ortholog of LST8，又名GL)和 raptor (regulatory-associated protein of mTOR)；mTORC2包括 mTOR、mLST8、mSIN1 (mitogen-activated protein kinase-associated protein 1)及 rictor (rapamycin insensitive companion of mTOR)。研究表明，雷帕霉素主要通过与细胞内受体 FKBP12结合而抑制 mTORC1，但是对 mTORC2无作用。目前研究较多的是 mTORC1复合物。rap
10、tor分子结构相对保守，分子质量为 150ku，所有 raptor家族成员都在 N-端有一段保守区及 3个 HEAT重复序列，mTOR 分子 N-端的重复序列使得它与 raptor结合紧密，而 C-端与 raptor结合较疏松5。如图 2所示，raptor 是一种桥梁分子，它可以将 mTOR与下游的靶分子如P70S6K、4EBP1 连接起来。但是，在营养素等上游因子不存在时，mLST8将 mTOR、raptor 紧密地锁在一起，使得 mTOR不能与其下游的靶基因结合；当营养素存在情况下，这一复合物发生空间构象改变，使得 mLST8和 raptor之间的结合断裂，暴露出 mTOR，从而使其下游靶
11、基因结合于raptor上6。对 mTORC2复合物研究不多，目前认为它可以通过磷酸化蛋白激酶 C-(PKC-)通路来调节肌动蛋白细胞骨架7。2 mTOR 信号传导途径2.1 mTOR 的上游信号传导途径 mTOR 可对细胞外包括生长因子、胰岛素、营养素、氨基酸、葡萄糖等多种刺激产生应答。它主要通过 PI3K/Akt/mTOR途径来实现对细胞生长、细胞周期等多种生理功能的调控作用。2.1.1 经典信号传导途径PI3K/Akt/mTOR 信号通路 PI3K 可被激活的 Ras通路以及一些生长因子及细胞因子激活，如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、血小
12、板源性生长因子、集落刺激因子等8。如图 3所示，这些细胞外生长因子配体与跨膜的酪氨酸激酶受体如胰岛素受体(IR)结合后，IR 的多个酪氨酸残基被磷酸化而激活；活化的 IR通过磷酸化其底物蛋白来招募PI3K的 p85亚基，并把信号传递给 p110亚基，导致 PI3K的激活；活化的 PI3K催化 PI-4-P与 PI-4，5-P2 的 3位磷酸化而生成 PI-3，4-P2 与PI-3，4，5-P3 后，后两者仍然在细胞膜上，召集下游分子 Akt到细胞膜上。PI-3，4，5-P3 可以激活磷脂酰肌醇依赖性激酶-1(PDK-1)，从而使Akt的 308位的 Thr磷酸化，在 PDK-2的存在下，其 4
13、73位的 Ser再被磷酸化从而使 Akt完全被激活。正常情况下，结节性脑硬化复合物-1(TSC-1)和 TSC-2形成二聚体复合物，是小 GTP酶 Rheb(Ras-homolog enriched in brain)的抑制剂，而 Rheb是 mTOR活化所必需的刺激蛋白，因此 TSC-1/TSC-2在正常情况下抑制 mTOR的功能。当 Akt活化后，它可磷酸化 TSC-2的 Ser939和Thr1462，抑制了 TSC-1/TSC-2复合物的形成，从而解除了对 Rheb的抑制作用，使得 mTOR被激活9。在整个 PI3K/Akt/mTOR信号通路中，有一条十分重要的负反馈调节剂就是 10号染
14、色体上缺失与张力蛋白同源的磷酸酶基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome 10, PTEN)。PTEN 是一个肿瘤抑制基因，位于人染色体 10q23。它有一个蛋白酪氨酸磷酸酶结构域，在这条通路中可以将 PI-3，4-P2 与 PI-3，4，5-P3 去磷酸化，从而负调节 PI3K下游 AKt/mTOR信号通路的活性10。2.1.2 非依赖 PI3K/Akt途径 越来越多的研究发现 AMPK(AMP-activated protein kinase A)与mTOR的活性调节有关。有研究表明在哺乳动物细胞系中，氨基酸的代谢调节
15、不是通过 PI3K/Akt/mTOR通路来实现的，而是直接通过LKB1/AMPK/mTOR通路来调节。在细胞中，当 ATP/ADP比率下降时，AMP的水平变化比 ATP的变化更为敏感。AMPK 的活性则对于细胞内 AMP水平非常细微的变化都能很快察觉到11。在缺乏能量的细胞内，AMPK 可以直接磷酸化并提高 TSC-2的活性，促进 TSC-1/TSC-2复合物形成，抑制Rheb酶活性，从而间接抑制 mTORC1通路的活性12。AMPK 在能量压力下还可以直接磷酸化 mTORC113。2.2 mTOR 的下游信号传导途径 活化的 mTOR通过磷酸化蛋白翻译过程中的某些因子来参与多项细胞功能，其中
16、最主要的是 4EBP1和 P70S6K。4EBP1：4EBP1(eIF4E-binding protein1)的 mRNA中含有从 DNA中转录得到的遗传信息，是蛋白质生物合成的模板。在真核生物蛋白质合成的起始阶段，由于 5端 mRNA的特殊帽状结构，核糖体不能直接与mRNA相结合，而是需要翻译起始因子的帮助。eIF-4E 又称为帽结合蛋白(cap-binding protein, CBP)，它与 mRNA的 5帽结构结合后再与 eIF-4G结合，eIF-4G 作为一种支架蛋白募集 eIF-4A形成三聚体复合物 eIF-4F，而此复合物可以使核糖体结合到 mRNA上从而起始蛋白质的翻译。4EB
17、P1有同 eIF-4G相似的 eIF-4E识别序列，故 4EBP1、eIF-4G 与 eIF-4E的结合存在部分重叠，4EBP1 可以通过竞争性抑制 eIF-4G与 eIF-4E的结合来达到抑制翻译起始的作用。mTOR 信号通路通过磷酸化 4EBP1，使 eIF-4E与其解离并活化，促使翻译起始复合物的形成，从而加速蛋白质的合成(图 4)。4EBP1 与 eIF-4E的解离，在活化一些位于 5-UTR(5-untranslated terminal region)区特殊的调控元件起着重要的作用，如 c-myc, cyclin D1以及鸟氨酸脱羧酶。相反，当生长因子或营养素缺乏，或者有 mTOR
18、抑制物存在时，4EBP1 去磷酸化，并与 eIF-4E结合从而抑制翻译起始14。3 mTOR 信号通路与肿瘤的关系近年来，很多关于雷帕霉素及其衍生物如 CCI-779、RAD-001 的作用研究，向我们展示了 mTOR信号通路在肿瘤发生发展中起着重要的作用。与肿瘤密切相关的多项细胞功能如细胞增殖、细胞周期、蛋白合成、细胞迁移等均受控于 mTOR的调节。现已发现许多肿瘤如乳腺癌、前列腺癌、肺癌中都有 mTOR信号通路的调节异常。3.1 PI3K/Akt/mTOR 通路的过度激活PI3K/Akt/mTOR 信号通路活化与多种肿瘤发生密切相关，它能够加速细胞周期、减少细胞凋亡、并促进肿瘤细胞的迁移，
19、这在脑胶质瘤、乳腺癌、卵巢癌中早已有报道16-18。活化的 PI3K可激活下游的 Akt，激活的 Akt使肿瘤细胞对凋亡诱导耐受、细胞生长代谢异常增加。过度活化的 Akt激活其下游的底物，包括糖原合成酶激酶 3(glycogen synthase kinase 3, GSK3)、6-磷酸果糖激酶-2、BAD 蛋白、内皮型一氧化氮合酶、mTOR、遗传性乳腺癌与卵巢癌易感基因(hereditary breast and ovarian cancer susceptibility gene, BRCA1)，其中激活的靶蛋白 mTOR可以引起肿瘤细胞的快速增殖、癌蛋白分泌增加、细胞周期加快、G1期时程
20、缩短，利于肿瘤的迅速发生发展19。在这条信号通路中，如前所述，PI3K 可以被 Ras信号、或者直接被一些生长因子所激活；PI3K的催化亚基 p110的异常扩增及突变亦出现在多种人类肿瘤中。Akt 可被多条途径激活，尤其是 PTEN基因的突变或缺失，这在前列腺癌、子宫内膜癌、胶质瘤和黑色素瘤中发生率最高20。在 1/3的上皮性肿瘤中发现了原癌基因 Ras可激活 Akt通路21；在很多肿瘤中发现了活化的受体酪氨酸激酶可以激活 Akt，可能是通过异二聚体 ErbB-2/ErbB-3激活PI3K途径来完成22。见表 1。表 1 肿瘤组织中 PI3K/Akt/mTOR通路的过度激活（略）3.2 PTE
21、N 功能的缺失 自从 PTEN发现以来，至今已在多种肿瘤中发现存在着 PTEN的改变。肿瘤细胞中 PTEN改变的主要形式之一是突变，包括插入、丢失、替换、移码突变、RNA 异常拼接和蛋白截短等，其最常见的突变发生于外显子 3、5、8。PTEN 的另一种改变形式是 5启动子区的 CpG岛甲基化。在PI3K/Akt/mTOR信号通路中，PTEN 的功能缺失使其对 PI3K的抑制作用解除，从而激活了 Akt/mTOR等下游信号通路。3.2.1 PTEN 的先天性遗传突变 PTEN 在 36%66%的子宫内膜癌中有突变，这在肿瘤中是突变率最高的，同时伴随 Akt的高磷酸化33。SOLIMAN 等34人
22、在 99例进展期子宫内膜癌标本中分析 PTEN、磷酸化的 Akt(p-Akt)、Ki-67(细胞增殖的一种标记)的表达，发现 66%的标本不表达或低表达 PTEN，同时有 40%的肿瘤高表达 p-Akt。PTEN 的低表达与 p-Akt的高表达显著相关。另外，该研究发现 PTEN(+)和 p-Akt(-)的患者拥有更高的生存率。p-AKT(-)使得 Ki-67的表达下调，且表达低水平 Ki-67的患者预后相对较好，也许能部分解释该现象。有趣的是，在子宫内膜非典型增生里 PTEN的突变率亦高达 20%30%。临床上使用口服黄体酮治疗子宫内膜非典型增生，但是只有 30%50%病例有效。在对黄体酮治
23、疗无反应的患者中发现有升高的或持续的 p-mTOR表达存在。另外，MUTTER 等35研究发现，子宫内膜腺癌中 PTEN突变率为 83%，癌前病变中达 55%，而正常子宫内膜中没有PTEN突变；同时在富含雌激素的子宫内膜的上皮组织中的 PTEN蛋白的表达缺失。这种激素和特殊的基因间的相互作用可能是导致癌前病变和癌发展的一个重要因素。以上所述均表明 PTEN突变是子宫内膜腺癌发生的早发事件，且 PTEN失活可能加速复杂性增生过长内膜发展为癌。30%40%的胶质瘤中存在 PTEN的突变、纯合子缺失及不表达。PTEN的失活与 p-Akt、p-mTOR、p-S6K1 的增加有关。CHAKRAVARTI
24、 等36在92例胶质瘤患者中研究发现，p-PI3K、p-Akt、p-S6K1 同 caspase3的水平相反，表明活化的 PI3K通路抑制凋亡。更重要的是，PI3K/Akt/mTOR通路的激活与胶质瘤的恶性程度增高和患者的生存率下降有关。Cowden病又称多发性错构瘤综合征，是一种常染色体显性遗传病，以累及所有三胚层分化组织的多器官、多发性错构瘤，同时存在乳腺癌及甲状腺癌高发病风险，及伴有 PTEN的体细胞突变为特征。Cowden 的先症者中有 80%有 PTEN基因种系突变，大约 2/3发生在外显子 5、7、8。尽管散发的甲状腺癌中少有 PTEN的体细胞突变，在 20%60%的甲状腺恶性肿瘤
25、中存在 10q23杂合子丢失，并且发生恶性侵袭性组织类别肿瘤的风险更高。例如，在 87例散发甲状腺肿瘤(14 例未分化癌、37 例滤泡性癌、21 例非典型性腺瘤、15 例普通腺癌)中有 6例标本存在 PTEN的 mRNA完全缺失，其中 4例都是未分化癌37。3.2.2 PTEN的后天修饰作用 除了先天因素如激酶区遗传性突变等引起 PTEN的功能改变以外，后天修饰如甲基化、与 DNA病毒癌基因产物结合而失活等，也会导致 PTEN功能的下降甚至丧失。PTEN 启动子的活性在过表达转录因子早期生长应答蛋白(transcription factor early growth response prot
26、ein 1, EGR1)时增加37。同样，使用甲状腺细胞系及非小细胞肺癌细胞系进行亚临床研究表明，PTEN 基因表达沉默与EGR1的 mRNA缺失相关38。在人类各种肿瘤中，24%74%肿瘤缺失PTEN蛋白的表达，这可能与 EGR1沉默了 PTEN的启动子有关。在宫颈癌中，PTEN 突变在早期肿瘤中发生较少，但是在进展期肿瘤中发生率明显增加，尤其是放疗后的肿瘤。相反，PTEN 基因的后天修饰作用，不论是因为杂合性丢失还是启动子区的甲基化，在早期宫颈癌包括宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)到进展期肿瘤中都有很多报道38。CHENG 等23对 62例宫颈鳞癌研究，使用单核苷酸多态性分析表明没有 PTEN的突变，仅有 8例存在杂合性丢失；但是 4/10例 CIN病例及 36/62例宫颈癌病例存在 PTEN启动子区甲基化。PTEN的功能丧失与其启动子区的甲基化有关。该研究表明 PTEN启动子区甲基化与患者的年龄、肿瘤分期及分级无关，但与预后有关，存在 PTEN启动子区甲基化患者预后明显较差。多变量回归分析模型证实，在控制患者的年龄、病理分级及临床分期后，PTEN 是无瘤生存率的一个重要指标。
