1、MAPK 信号途径介导的 17-雌二醇快速激活人精子的研究【摘要】 目的 观察 17-雌二醇(E2) 对人精子快速的非基因组激活效应，并探讨其相关的作用机制。方法雌激素受体拮抗剂Tamoxifen (0.05mol/L)预处理 20min 后，分别用 E2 (1mol/L)、雌二醇-牛血清白蛋白结合物（E2-BSA，5mol/L）作用获能人精子15min，以三色法染色检测获能人精子顶体反应率，Western blotting 检测丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)蛋白的表达变化。结果 E2、E2-BSA 均能提高人精子的顶体反应率和促进 p42/p44 磷酸化 MAPK 蛋白的表达，且两者的作用均
2、可被 Tamoxifen 所阻断。结论人精子膜上可能存在膜雌激素受体(mER)，雌激素与 mER 结合后可通过 MAPK 信号途径快速激活人精子。 【关键词】 17-雌二醇； 人精子；顶体反应；膜雌激素受体；丝裂原活化蛋白激酶AbstractObjective To study the rapid non-genic effect and mechanism of 17-estradiol on human spermatozoon activation.Methods Human spermatozoa were cultivated with E2(1mol/L) or E2-BSA(5m
3、ol/L) for 15 minutes after treated with tamoxifen(0.05mol/L)for 20 minutes.Acrosome reaction rates were scored by trichrome staining and MAPK activity was determined by Western blotting.ResultsE2 or E2-BSA significantly increased the acrosome reaction rates and MAPK activity (p42/p44).The effects of
4、 E2 or E2-BSA were able to be inhibited by tamoxifen.ConclusionsThere may be some membrane estrogen receptors on the human spermatozoa,which mediate the rapid activational effects of estrogen on human spermatozoa through MAPK pathways.KEYWORDShuman spermatozoonacrosome reactionmembrane estrogen rece
5、ptormitogen-activated protein kinase越来越多的研究资料证明，雌激素在精子的成熟及精子功能的获得中都起着非常重要的调节作用，体外环境下，雌激素对精子有一定的激活效应，在精子运动力的获得、精子蛋白的酪氨酸磷酸化、获能、顶体反应和受精等过程中有重要的促进作用1 。但迄今为止，雌激素人精子激活作用的机制尚未完全阐明。为此，本实验用 17-雌二醇（E2）作用正常人获能精子，观察雌激素对人精子激活的指标之一顶体反应的影响，并探讨参与该过程的 MAPK 信号通路。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 主要试剂 17-雌二醇（E2） 、雌二醇-牛血清白蛋白复合物（E2-BS
6、A） 、牛血清白蛋白（BSA） 、雌激素受体(ER)拮抗剂 Tamoxifen 均购自 Sigma 公司；兔抗 p-44/42 单克隆抗体购自 Cell Signaling 公司；化学发光增强剂购自 New England Biolabs 公司；台盼蓝购自 Chroma 公司；俾士麦棕 Y 购自美国 Schmid GMBH 公司；玫瑰红购自 Fluka 公司。1.1.2 精液标本采集实验所用 33 例精液标本来自年龄 2545 岁有正常生育史身体健康的成年男性志愿者，其精液常规各项指标符合WHO 制定的正常精液常规标准2 。1.1.3 精子悬液制备供精者禁欲 37d 后手淫获取精液，将精液标本
7、置于 37孵箱（5CO2）中 40min，使其完全液化。用上游技术获取活动良好的精子，经 BWW 低蛋白液（含 0.3%BSA）洗涤 3 次后，用 BWW 获能液（含 3.5%BSA）调整精子密度至 20109/L，在孵箱中孵育 4h 使精子获能。1.2 方法1.2.1 三色法检测精子顶体反应（AR）率经各实验因素处理后，获能精子悬液与 1%的台盼蓝以体积比 3：1 混合，37孵育 20min，离心、无蛋白 BWW 液洗涤 2 次，涂片、室温干燥，75%乙醇固定 30min，双蒸水冲洗、俾士麦棕 Y 染色、玫瑰红复染，最后用 85%，95% 和 100%的乙醇逐级脱水、二甲苯透明，树脂封片后观
8、察。每张涂片在油镜下计数 200个精子，计算 AR 率。1.2.2Western blotting 检测精子磷酸化 MAPK 蛋白（p42/p44）表达精子经实验因素处理后进行离心、裂解，用 BCA 法测定精子蛋白浓度3 。所得蛋白提取液进行 SDS-PAGE 电泳，以湿转法将蛋白转移至 PVDF膜上，封闭 1h 后，加入一抗体（抗 p42/p44 磷酸化单克隆抗体，1:3000）室温孵育 1h，PBST 洗膜 3 次，之后加入二抗（HRP 标记羊抗鼠IgG，1:5000）室温孵育 1h，PBST 洗膜 3 次，与 ECL 发光底物反应2min，X 光片曝光、显影定影。用抗人肌动蛋白抗体 -a
9、ction 作为内参照，进行二次免疫印迹。用图像处理系统对 X 光片进行扫描测定感光区带的灰度值，以 p42/p44 蛋白条带与 -action 条带的比值表示磷酸化p42/p44 MAPK 蛋白的表达量。1.2.3 统计学处理实验数据均以s 表示，利用 SPSS11.5 统计学软件进行方差分析，P0.05 被认为有统计学意义。2 结果2.1E2、E2-BSA 对人精子 AR 率的影响结果如表 1 所示。与空白对照组相比，E2（1mol/L） 、E2-BSA（5mol/L）作用 15min 后，精子顶体反应率均明显提高（P0.05） ，且两作用组间无显著差异(P0.05)；Tamoxifen（
10、0.05mol/L）预处理精子 20min 后，E2（1mol/L） 、E2-BSA（5mol/L）诱导的精子顶体反应率明显受到抑制，且显著低于E2（1mol/L） 、E2-BSA（1mol/L）单纯诱导的精子顶体反应率；Tamoxifen（0.05mol/L）单纯作用组对精子顶体反应率无明显影响（P0.05） 。表 1Tamoxifen 对 E2、E2-BSA 诱导精子顶体反应率的影响（略）注：* P0.05 vs control,# P0.05 vs E2, P0.05 vs E2-BSA2.2E2、E2-BSA 对人精子 p42/p44 磷酸化 MAPK 蛋白表达的影响本实验以磷酸化 p
11、42/p44 MAPK 蛋白与内参照肌动蛋白 -actin条带的灰度值比值表示 MAPK 活性的变化，图 1 为 Western blotting 检测结果。各组磷酸化 p42/p44 MAPK 蛋白表达量分别为：对照组（0.70250.1471、0.74460.1559） ，E2（1mol/L）单独作用组（0.82950.1936、0.97990.2052） ，E2-BSA（5mol/L）单独作用组（0.79930.1568、0.95320.1662） ，Tamoxifen（0.05mol/L）+ E2（1mol/L）作用组（0.69950.1402、0.73440.1472） ，Tamox
12、ifen（0.05mol/L）+ E2-BSA（5mol/L）作用组（0.67390.1347、0.70760.1418） ，Tamoxifen（0.05mol/L）单独作用组（0.70030.1420、0.73530.1496） 。统计分析显示，E2（1mol/L） 、E2-BSA（5mol/L）作用获能精子 15min 后，均可显著增加精子内 p42/p44 磷酸化 MAPK 蛋白的表达（P0.05，P0.01)。用雌激素受体拮抗剂 Tamoxifen 预处理人精子 20min 后，可明显抑制E2、E2-BSA 的作用（P0.05，P0.01)。Tamoxifen 单独作用对p42/p44
13、 磷酸化 MAPK 蛋白表达无明显影响(P0.05)。3 讨论雌激素的非基因组效应（即不经过 DNA 转录、mRNA 生成、蛋白质合成过程的快速效应）是近年来的研究热点之一。在雌激素对雄性动物生殖功能影响的研究中，也发现了非基因组效应的存在，在短时间内雌激素就可实现相应的调节作用4 。精子激活的最终结果表现为顶体反应，是决定精子受精能力的重要前提。已有研究发现，高活性的雌激素物质 17-雌二醇（E2）可提高人精子的顶体反应率5 ，但目前 E2 促进精子发生顶体反应的具体机制还未阐明。在本实验中，我们用 E2 短时间（15min）作用获能人精子后，精子的 AR 率明显提高。成熟人精子的 DNA
14、呈高度凝聚状态，几乎没有蛋白的合成，因此，E2 对人精子的激活作用可能不依赖基因转录，而是一种快速的非基因效应。为探讨 E2 快速诱导精子发生顶体反应是否借助于膜信号途径来实现，我们用非透膜性大分子物质 E2-BSA 作用人精子相同时间，发现 E2-BSA 亦可明显提高精子的顶体反应率且与 E2 的作用相似。E2-BSA 是一种雌激素大分子复合物，其中不含游离的雌二醇，该物质不能透过细胞膜发挥作用，因此，我们推测雌激素可能借助于某些膜信号途径参与的非基因组效应快速激活精子。Baldi 等人用免疫沉淀和Western Blot 的方法检测到在人精子膜上存在一种蛋白，可能是雌激素的一种非基因组型受
15、体，其分子量只有 29kDa，小于经典的核 ER 和ER6 。国内外研究报道及本实验的研究结果均证明成熟人精子膜上可能存在雌激素受体（mER） ，雌激素与 mER 相互作用后可快速诱导精子发生顶体反应。目前，人精子 mER 的分子结构尚未阐明，本实验中，我们用核雌激素受体拮抗剂 Tamoxifen 预处理人精子后，发现 Tamoxifen可明显抑制 E2、E2-BSA 快速诱导精子发生顶体反应的作用，这提示人精子的 mER 与传统核 ER 在结构上可能存在有相近之处。为进一步探讨雌激素通过 mER 快速激活精子的膜信号转导途径，我们观察了 MAPK 信号途径在其中的作用。MAPK 为多种细胞外
16、信号（激素、神经递质、细胞因子和生长因子等）从细胞表面受体传向细胞内的一条重要信号转导通路。本研究发现，E2、E2-BSA 作用于人精子 15 min，p42/p44 磷酸化 MAPK 蛋白含量明显增多，使用雌激素受体拮抗剂Tamoxifen 预处理后可抑制 E2 的作用。以上结果表明，雌激素快速诱导精子发生顶体反应的作用可能是通过 MAPK 信号转导途径实现的。有关雌激素快速引起生物效应的跨膜信号通路，目前有多种解释，包括 PKA、PKC、PKG、一氧化氮合酶和 PI3-Kinase-Akt 等，其中 G 蛋白偶联的受体信号通路可能是较重要的途径之一7 。有报道证明，E2 作用于 mER 后
17、可通过 G 蛋白作用进而激活 PKC，亦可快速升高细胞内 cAMP水平，引起胞外钙离子内流和胞内蛋白的酪氨酸磷酸化8 ，Lamirande等认为 MAPK 信号通路参与了人精子的成熟、获能和顶体反应的过程,使用 MAPK 激酶的特异性抑制剂可导致使精子顶体反应率和精子蛋白的酪氨酸磷酸化水平降低9,因此我们推测 E2 有可能通过 PKC、钙离子、酪氨酸激酶等信号途径激活 MAPK。另外，E2 的快速激活作用也可由和 PI3-kinase-Akt 信号通路所介导10 ，在这个过程中，MAPK 信号转导通路与 PI3-kinase-Akt 信号通路之间是否存在关联目前尚不清楚。综上所述，雌激素可借助
18、于膜雌激素受体快速激活人精子，MAPK相关的信号转导通路可能参与了此过程，这为进一步阐明雌激素影响精子功能的作用机制提供了一定实验依据。【参考文献】Rochira V,Granata AR,Madeo B,et al.Estrogens in males: what have we learned in the last 10 yearsJ. Asian J Androl.2005;7(1):3-20.2World Health Organization.WHO laboratory manual for the exanlination of human sperm and sperm -c
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