1、PPAR 配体罗格列酮对大鼠扩张型心肌病的疗效及可能机制【摘要】 观察 PPAR 配体罗格列酮对多柔比星诱导的扩张型心肌病的治疗作用，并探讨可能机制。方法： 30 只雄性 SD 大鼠随机分为（1）正常对照组（CON, n=10） ，等体积生理盐水灌胃；（2）扩张型心肌病组（DCM, n=10） ，多柔比星 2.0 mgkg-1 腹腔注射，每周 1 次，共 8 周；（3）扩张型心肌病罗格列酮组（DCM+RSG, n=10） ，罗格列酮 3.0 mgkg-1d-1 灌胃治疗，共 12 周。第 15 周检测心肌相关炎症因子浓度以及总抗氧化能力（TAOC） 、丙二醛（MDA）浓度；检测心功能。结果：
2、DCM 组与 CON 组相比左室射血分数（LVEF） ，+dp/dtmax，-dp/dtmax，TAOC 显著降低（P0.05） 。心肌中TNF ，IL1 ，IL6 ，MDA 及胶原容积百分数（CVF）明显升高（P0.05） ，罗格列酮治疗后 LVEF，TAOC 有所改善（P0.05） ，TNF ，IL1 ，IL6 ，MDA，CVF 有所降低（P0.05） 。结论： PPAR 配体罗格列酮可改善扩张型心肌病大鼠的心功能，其机制可能是提高心肌抗氧化能力、减少炎症因子的释放。 【关键词】 过氧化物酶体增殖物激活受体 扩张型心肌病 化应激 炎症因子Abstract Objective: To obs
3、erve the effect of administration peroxisome proliferatoractivated receptor agonist Rosiglitazone on dilated cardiomyopathy (DCM)rats induced by adriamycin and its mechanism.Methods： Thirty male SpragueDawley rats were randomly divided into 3 groups as follows.1)the control group (CON, n=10):The sam
4、e dose of normal sodium was administered by daily gavage.2)the dilated cardiomyopathy group (DCM, n=6): Adriamycin was administered intraperitoneally for 8 weeks.3)the dilated cardiomyopathy +Rosiglitazone group (DCM+RSG, n=6).concomitant adriamycin and rosiglitazone, rosiglitazone administered dail
5、y gavage at a dose of 3mgkg-1d-1 for 12 weeks.The concentration of TNF,IL6,IL1,TAOC,MDA in myocardium were obtained at 15 weeks after treatment.The cardiac function was assessed by echocardiography, hemodynamics at the same time.Results： To compare the DCM group with the CON group, significantly dec
6、rease of left ventricular ejection fraction (LVEF), +dp/dtmax,-dp/dtmax and TAOC was observed(P0.05), while the concentration of TNF, IL1, IL6, MDA in myocardium, collagen volume fraction(CVF)were all significantly increased(P0.05).LVEF, TAOC were improved (P0.05)by rosiglitazone treatment.Concentra
7、tion of TNF, IL1, IL6,MDA in myocardium and CVF were decreased(P0.05)by rosiglitazone treatment.Conclusion： Proliferator activated receptor agonist rosiglitazone can improve cardiac function in a rat model of dilated cardiomyopathy induced by adriamycin, and the antiinflammatory, antioxidative stres
8、s might be two of the mechanisms.Key words PPAR; dilated cardiomyopathy; oxidative stress; inflammatory factor扩张型心肌病（dilated cardiomyopathy, DCM）是一种以心脏扩大和左心室或全心收缩功能下降为主要特征的常见心肌疾病，其具体的病理生理机制目前尚不明确。过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferatoractivated receptor , PPAR）是一类由配体激活的核转录因子，近年研究发现其在心血管系统有表达1 ，同时体内和体外
9、实验均提示 PPAR 由配体激活后可以改善心室重构2 。本实验旨在观察 PPAR 配体罗格列酮（rosiglitazone, RSG）对多柔比星诱导的扩张型心肌病大鼠心功能、心室重构、氧化应激及炎症因子的影响，并探讨其中的可能机制。1 材料和方法1.1 材 料1.1.1 实验动物 健康 8 周龄雄性 SD 大鼠 30 只，体质量（27020）g，由江苏大学医学院实验动物中心提供。1.1.2 药品及试剂 多柔比星（浙江海正药业有限公司馈赠） ；罗格列酮钠（太极集团馈赠） ；氯胺酮（购自江苏恒瑞医药有限公司） ；心肌组织 TNF ，IL1 ，IL6 放射免疫试剂盒（购自北京福瑞生物工程公司） ；总
10、抗氧化能力（TAOC） 、丙二醛（MDA）测定试剂盒（购自南京凯基生物科技发展有限公司） ；VG 染色试剂盒（购自福州迈新生物技术开发有限公司） 。1.1.3 实验仪器 Agilent Sonos5500 彩超仪，S12 型高频超声探头（美国 Agilent 公司） ；小动物电生理记录仪（澳大利亚 Powerlab 公司） ；超声波细胞破碎仪（美国 Branson 公司） ；核酸蛋白定量仪（德国 Eppondof 公司） ；病理切片机（德国 Leica RM2135） ；显微照相及图像分析系统（德国 Leica QWIN3） 。1.2 方 法1.2.1 动物分组与给药 （1）正常对照组（ CO
11、N 组 n=10） ，生理盐水 2.0 mlkg-1d-1 灌胃，共 12 周；第 5 周起使用生理盐水 1.0 mlkg-1 腹腔注射，每周 1 次，至第 12 周；（2）扩张型心肌病组（DCM组 n=10） ，生理盐水灌胃同 CON 组，第 5 周起使用多柔比星 2.0 mgkg-1（2.0 mgml-1）腹腔注射，每周 1 次，至第 12 周（共 8 周） ；（）扩张型心肌病+罗格列酮组（DCM+RSG 组 n=10） ，罗格列酮钠 3.0 mgkg-1d-1（1.5 mgml-1）灌胃，共 12 周，多柔比星腹腔注射同DCM 组。多柔比星注射完毕后观察 2 周，于第 15 周进行心脏彩
12、超和血流动力学检测，留取标本检测相关指标。1.2.2 心脏超声检测 氯胺酮（100 mgkg-1）腹腔注射全身麻醉大鼠，测定体质量，采用 S12 型探头，频率 512 MHz，取左室短轴切面，在二维影像指导下用 M 超测量左室舒张末期内径（LVEDD） ，左室收缩末内径（LVESD） ，左室射血分数（LVEF） ，左室短轴缩短率（LVFS） 。所有指标均在 3 个连续的心动周期中由 2 名观察者分别观测，取平均值。1.2.3 血流动力学检测 大鼠颈部正中切口，分离出右颈总动脉，将软质导管自右颈总动脉插入左心室，尾部连接 Powerlab 八通道生理记录仪的压力传感器，观察并同步记录压力 容积曲
13、线（pressurevolume curve，PV） ，测算左心室压峰值（LVSP） 、收缩期dp/dtmax（+dp/dtmax),左室舒张末期压（LVEDP） 、舒张末期 dp/dtmax(-dp/dtmax)。1.2.4 心室质量及指数测定 血流动力学检测完成后开胸，取出心脏，以 4肝素生理盐水冲洗，滤纸吸干后称取含室间隔的左心室实际质量（LVAW） 、右心室实际质量（RVAW） ，分别除以体质量后得出左室质量指数（LVWI）和右室质量指数（RVWI） 。1.2.5 心肌组织 TNF ，IL1 ，IL6 ，TAOC，MDA 检测 取心尖部心肌组织约 100 mg，充分匀浆，4 3 000
14、 r/min 离心 15 min，取上清 BCA 法行蛋白定量，于-80保存，按放免试剂盒测定步骤测定 TNF ，IL1 ，IL6 ；按试剂盒说明比色法测定 TAOC 和MDA。1.2.6 组织病理学检测 心脏标本置 4%中性甲醛液固定，取左室中段心肌组织 23 mm 厚，常规石蜡包埋、切片，行 HE 染色；按 VG 染色试剂盒操作步骤行 VG 染色，用 Leica QWIN3 图像分析系统在 400 倍下行图像分析，每张切片选取 4 个不重叠视野，计算每个视野中胶原组织所占百分比（心肌胶原容积百分比=胶原面积/全视野面积100%） ，取平均数代表 CVF。1.2.7 统计分析 所有数据均以均
15、数标准差表示，采用 SPSS12.0软件分析数据，组间比较采用单因素方差分析，两组比较用 SNK 法，P0.05 为差异有统计学意义。2 结 果2.1 死亡率 CON 组大鼠无死亡。DCM 组共死亡 4 只，死亡率为 40%。DCM+RSG组死亡 2 只，死亡率为 20%，较 DCM 组明显降低（P0.05） 。2.2 心脏超声测定结果 与 CON 组相比，DCM 组 LVEDD，LVESD 增高（P0.05） ，LVFS，LVEF 均显著降低（P0.05） ；罗格列酮治疗后，LVESD，LVEDD，LVFS，LVEF 均有明显改善（P0.05） 。见表 1。 表 1 各组大鼠超声心动图及血流
16、动力学检测结果2.3 血流动力学结果 DCM 组 LVSP，+dp/dtmax，-dp/dtmax 显著低于 CON 组（P0.05） ，LVEDP 高于 CON 组（P0.05） ；使用罗格列酮治疗后LVSP，+dp/dtmax，-dp/dtmax 均有所升高，LVEDP 有所降低（P0.05） ，但未恢复正常。见表 1。2.4 心室质量及指数DCM 组 LVAW，RVAW，LVWI 和 RVWI 均明显高于 CON 组（P0.05） ，罗格列酮可以使 LVAW，RVAW，LVWI，RVWI 得到改善（P0.05） ，但仍高于 CON 组。见表 2。表 2 各组大鼠心室质量及心室质量指数检测
17、结果2.5 心肌组织 TNF ，IL1 ，IL6 测定值DCM 组心肌组织中 TNF ，IL1 ，IL6 的表达均明显增高。罗格列酮治疗后心肌组织中上述因子的表达水平均有所降低（P0.05）,见表 3。2.6 心肌组织 TAOC，MDA 测定值DCM 组 TAOC 降低，MDA 增高，使用罗格列酮后 MDA 水平有降低（P0.05） ，TAOC 改善明显（P0.05）,见表 3。表 3 各组大鼠心肌组织中 TNF ，IL1 ，IL6 ，TAOC，MDA 测定值2.7 组织病理学检测结果大鼠心肌 HE 染色显示 DCM 组心肌细胞片状变性坏死，心肌细胞明显肿胀、间隙增宽、心肌纤维局限性断裂，淋巴
18、细胞浸润和成纤维细胞增生；DCM+RSG 组心肌细胞仅仅有点状变性坏死，心肌细胞肿胀及淋巴细胞的浸润均有改善，见图 1。大鼠心肌 VG 染色显示在病灶部位出现红色胶原染色，在病灶局部胶原结缔组织增生，间质纤维化，CON 组仅见少许胶原，DCM 组可见胶原大量增生，两组 CVF 分别为(2.680.5)%和(11.551.1)%，差异有统计学意义（P0.05） ；DCM+RSG 组 CVF 为(6.910.5)%，显著低于 DCM 组（P0.05） 。见图 2。3 讨 论罗格列酮是 PPAR 的特异性配体之一，两者结合后通过与某些基因上游特异的 DNA 反应元件相互作用及非 DNA 结合依赖模式
19、调控基因表达，参与病理生理反应的调节3 。在对心肌缺血/再灌注、心肌梗死、压力负荷性心衰动物模型的研究中发现 PPAR 配体对心功能产生了有益作用，但其对扩张型心肌病的作用尚不明确。本研究采用多柔比星腹腔注射致大鼠扩张型心肌病模型，其LVEDD，LVESD，LVWI，RVWI 均扩大，LVEF，+dp/dtmax，-dp/dtmax 下降明显，与人类临床扩张型心肌病特征基本相符4 。临床研究显示，多柔比星在应用早期就可以通过促进炎症因子的释放和氧化应激通路导致心功能下降5 ，相关炎症因子在心衰早期即可被激活，而且比经典的神经内分泌因子激活更早6 。因此，我们采用 PPAR 配体罗格列酮预处理的
20、方法，使得有效的血药浓度覆盖了 DCM 病理生理变化的整个过程，能在 DCM 早期进行干预。结果显示，罗格列酮预处理有效改善了 DCM 大鼠的心室扩张程度和心室重构，使心功能和生存率得到提高。临床发现扩张型心肌病患者心肌细胞能够分泌 TNF 7 。动物实验也显示超氧化物在扩张型心肌病的叙利亚地鼠中明显升高8 ，PPAR 的缺乏可以导致大鼠心肌抗氧化能力的下降，最终进展为扩张型心肌病而死亡9 。PPAR 配体可以有效提高其心室中 PPAR 蛋白含量，抑制心室肥大、改善心室重构、提高心功能10,11 ，PPAR 共活化物的缺乏可以导致心功能的进一步恶化12 。本组 DCM 大鼠心肌组织中IL1 ，
21、IL6 ，TNF 均明显升高，总抗氧化能力下降，心肌坏死明显并伴有大量胶原增生。PPAR 配体罗格列酮预处理后 DCM 大鼠心肌中IL1 ，IL6 ，TNF 浓度降低，总抗氧化能力提高，心肌细胞坏死减少，心室纤维化得到改善。诸多相关研究提示：IL1 ，IL6 ，TNF 的增加促进了大鼠心室中成纤维细胞的活动13 ；增强了基质金属蛋白酶活性，从而促进细胞外基质增生14 ；TNF 亦促进了心肌坏死15 ；机体内氧自由基相对或绝对产生过多，引发脂质过氧化作用，心肌的总抗氧化能力明显下降，心肌出现坏死；这些作用使心脏最终走上病理性重塑。PPAR配体对心肌的保护机制可能是：通过 NFB ，AP1 ，JN
22、K 等细胞通路减少心衰时相关炎症因子的释放，减轻炎症反应16 ，同时，对炎症因子的抑制作用也间接抑制了超氧化物的产生；通过促进和激活Cu/Zn-SOD 的表达来减少超氧化物的生成和抑制 NADPH 氧化酶亚单位p22phox 的表达来干预氧化应激反应17 ；也可以通过诱导型氧化亚氮合酶的表达产生抗氧化作用18 ，从而调控MMP2 ，MMP3 ，MMP9 的表达，抑制心室纤维化。综上可见，多柔比星导致的扩张型心肌病和其他扩张型心肌病的病理生理过程有相似之处，炎症反应和氧化应激在扩张型心肌病的发生发展中起着极为重要的作用，而 PPAR 配体预处理可以通过抑制炎症因子的分泌和增强心肌的抗氧化能力对心
23、肌产生保护作用，从而改善心室重构，提高心功能。在本研究中，罗格列酮对 LVEDD 改善不如 LVESD 明显，但 LVEF 明显改善，不排除 PPAR 配体对心肌收缩力的影响，其机制尚待研究。多柔比星导致的扩张型心肌病中，PPAR 配体通过哪种通路干预炎症反应和氧化应激，以及对心肌细胞凋亡、电生理重构等的影响尚不甚清楚，有待进一步研究以明确。【参考文献】1 BishopBailey D.Peroxisome proliferatoractivated receptors in the cardiovascular systemJ.Br J Pharmacol,2000,129(5): 823-
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