1、RPHPLC 法检测海马脑片灌流液中氨基酸类神经递质作者：王晓菲 罗晓星 周四元 赵德化 程涛 潘小军 【关键词】 谷氨酸 关键词: 高效液相色谱;海马;天门冬氨酸;谷氨酸;牛磺酸;-氨基丁酸 摘 要:目的 建立一种可同时测定微量谷氨酸（Glu） ，天门冬氨酸（Asp） ，牛磺酸（Tau） ，-氨基丁酸（GABA）4 种氨基酸类神经递质的HPLC 分析方法. 方法 制备大鼠海马脑片，灌流取样，冻干再溶后，采用邻苯二甲醛（OPA）柱前衍生，反相梯度洗脱的高效液相/荧光检测法，测定其中 4 种微量氨基酸的含量. 结果 各氨基酸的浓度与峰面积均呈现良好的线性关系，相关系数（r）分别为:Asp0.99
2、20，Glu0.9667，Tau0.9803 和 GABA0.9584;日内变异系数（%）为 Glu4.3，Asp4.6，Tau6.7 和 GABA7.1;最低检出限（pmol L-1 ）为:Asp0.17，Glu0.35，Tau0.68 和 GABA1.12，标准加入回收率（%）分别为:Asp1067，Glu1015，Tau946 和 GABA9211. 结论 该法具有衍生化反应操作简便，流动相成本低，灵敏度高，特异性强，分析时间短的优点，而且同样适用于其他生物样品的测定. Keywords:HPLC;hippocampus;aspartic acid;glulamate;taurine;G
3、ABA Abstract:AIM To establish a method for simultaneous de-termination of trace amino acid neu rotransmitters Glu，Asp，Tau and GABA by HPLC was improved.METHODS The sample prepared by rat hippocampal slices perfusation was lyophi-lized and resoluted，4kinds of trace amino acids were determinated by HP
4、LC which involved pre-column derivatiza-tion with o-phthalaldehyde，reversed-phase gradient elution and fluorescence detection.RESULTS A good linear rela-tionship existed between peak area and concentration of amino acids.The correlation coefficients（r）were:Asp0.9920，Glu0.9667，Tau0.9803and GABA0.9584
5、respec-tively.The precisions（%）were Glu4.3，Asp4.6，Tau6.7and GABA7.1for interassay CV.The detection limits（pmol L-1 ）were:Asp0.17，Glu0.35，Tau0.68，GABA1.12and the recovery rates of4amino acids（%）were Asp1067，Glu1015，Tau946and GABA9211respectively.CONCLUSION The operation of the derivatization is easy，
6、the mobile-phase is cheap and this method has suffi-cient sensitivity，specificity and less separation time.Also it is good for determination of amino acid in other biologic sam-ple. 0 引言 谷氨酸（Glu） 、天门冬氨酸（Asp） 、-氨基丁酸（GABA）和牛磺酸（Tau） ，是大脑海马结构中分布最广泛研究最多的神经递质，前两者属于兴奋性递质，后两者属于抑制性递质.这些氨基酸类递质的异常是诱发多种神经系统疾病，如
7、兴奋性毒性反应、癫痫、舞蹈病、帕金森病的因素之一1，2 .随着对神经药理学研究的深入和临床神经系统疾病病因的探索，要求建立一种快速、精确的微量氨基酸定量分析方法.经典的氨基酸分离方法是离子交换色谱法3 ，此法需特殊装置，且分析时间较长;而荧光分光光度法和氨基酸自动分析仪检测灵敏度较低，且干扰因素较多4 .我们以大鼠的海马脑片灌流液为标本，以邻苯二甲醛为柱前衍生剂，建立起一种更简便、更灵敏，适于检测生物样品中微量氨基酸的高效液相色谱分析方法. 1 材料和方法 1.1 材料 美国 Agilent-1100 系列高效液相色谱仪及荧光检测器，梯度设置及数据均由 on-line 计算机数据处理系统处理.
8、邻苯二甲醛（OPA） ，2-巯基乙醇，L-Glu，GABA，Asp，Tau 及乙醇胺均购自 Sigma 公司.甲醇为色谱纯（进口）.其余试剂均为分析纯（国产）.试剂用水为三蒸水. 1.2 方法 1.2.1 色谱条件 色谱柱为 Hypesil ODS 柱（4.6mm100mm，粒径5m） ，流动相包括:甲醇和乙酸钠（0.1mol L-1 ，用冰醋酸将 pH 值精确调至 5.52） ，流速 0.9mL min-1 ，柱温:30，荧光检测激发波长为340nm，发射波长为 455nm.三步梯度洗脱步骤为:甲醇 250430mL L-1 ，1min;甲醇 430700mL L-1 ，10min;甲醇 7
9、00900mL L-1 ，1min;维持甲醇固定比率 900mL L-1 ，1min;最后，甲醇由 900250mL L-1 返回，1min，总洗脱时间为 15min. 1.2.2 标准曲线的制备 准确称取 Glu，GABA，Asp，Tau 标准品，用 0.05mol L-1 NaHCO3 溶液配制成不同浓度的标准品，分装，-20保存，待测. 1.2.3 生物样品的收集和预处理 SD 大鼠（，250350g，一级动物，第四军医大学实验动物中心提供）断头取脑，在冰台上迅速解剖出海马，沿海马长轴手动切制脑片，厚度:200400m.放入自制灌流器中进行灌流.灌流介质为 Kreb 液，配比（mmol
10、L-1 ）:NaCl117，KCl3.6，NaH 2 PO4 1.2，MgCl2 1.2，CaCl2 2.5，NaHCO3 25，Glucose11.5.持续通入混合气（O2 950mL L-1 ，CO2 50mL L-1 ）恒温 37，恒速 0.4mL min-1 ，灌流器容积 0.5mL，可容纳 5 片脑片.灌流方向由底向上.将恒流 0.4mL min-1 的灌流液每 3min 收集一个样本（1.2mL）.样品在-20可保存数月，为增加其敏感性.样品可低温冻干，用时用 400L 水再溶，低温离心，取上清液备用. 1.2.4 柱前衍生 5mg（OPA）溶于 100L 甲醇中，加入 5L2-巯
11、基乙醇，再用硼砂-氢氧化钠缓冲液（0.4mol L-1 ，pH9.5）稀释至 5mL，配制成衍生化溶液（含 OPA7.5mmol L-1 ） ，24h 后使用.取标准液或处理后样品 30L，加入 2 倍体积的 OPA 液在室温下反应，精确记时在微型混合器上混匀 30s，静置 1min 后立即进样，每次进样 20L. 2 结果 2.1 色谱图 在选定的色谱条件下，经 15min 梯度 洗脱，可得各氨基酸分离峰，海马脑片灌流液样品分离效果令人满意（Fig1，2）. 图 1 图 2 略 2.2 回归方程和最低检出限 以浓度（X）为横坐标，待测组分的峰面积与相应内标物的峰面积比值（Y）为纵坐标制作标准
12、曲线.所得各氨基酸的线性回归方程分别为:Asp Y=1.942+0.127X（r=0.9920）;Glu Y=1.559+0.104X（r=0.9667）;Tau Y=2.959+0.222X（r=0.9803）;GABA Y=0.607+0.046X（r=0.9584）;当信噪比为 3 1 时，4 种氨基酸的最低检出限分别为:（pmol L-1 ）:Asp0.17，Glu0.35，Tau0.68，GABA1.12（n=8）. 2.3 标准品加入回收率和精密度 向海马灌流液样品中加入一定量的氨基酸混合标准品，利用增量法计算该方法的回收率（%）分别为:Asp1067，Glu1015，Tau946
13、，GABA9211.为考察方法的重现性，对同一样品同日内重复测定 5 次，不同日内重复测定 5 次，获得日内变异系数（%）为 Glu4.3，Asp4.6，Tau6.7，GABA7.1;日间变异系数（%）为 Glu6.1，Asp6.9，Tau7.2，GABA8.6. 2.4 样品分析 依 1，2，3 制备的样品测定得出正常大鼠海马脑片灌流液中氨基酸的释放量pmol min-1 mg-1 ，x s，n=8为:Asp3.070.63;Glu8.570.95;Tau4.060.76;GABA1.531.08. 3 讨论 海马脑组织切片具有独特而简单的三层结构皮层、明确而完整的神经回路及主要细胞类型较少
14、的特点，是进行神经药理学研究的常用标本1 .兴奋性神经递质 Glu，Asp 与抑制性神经递质 GABA，Tau 的含量变化及二者比例的改变是研究神经系统疾病常用的重要生化指标.这些氨基酸往往不具有紫外吸收，也不发射荧光.因此，需将它们转变为能被检测的高灵敏度衍生化产物.OPA 是目前应用最广泛的柱前衍生化试剂，反应迅速，而且剩余物质不干扰分离和检测.衍生化合物选用荧光检测器，较紫外检测的灵敏度大大提高5，6 . 我们首次利用此种分析方法对脑片组织灌流液中的微量氨基酸成分进行测定，首先优选了色谱条件:提高缓冲液中 Na+ 浓度，可增强氨基酸衍生物的疏水性，使各相邻色谱峰之间保留时间的差值拉大，有
15、利分离，所以我们选择乙酸钠作为流动相成分7 ;在实验过程中发现，流动相的离子浓度和 pH 值对分辨率及分析结果有较大影响（荧光物的荧光效率与 pH 值有关）.分别用不同离子浓度不同 pH 值的乙酸钠缓冲液作为流动相，优化出最佳的流动相为 0.01mmol L-1 ，pH5.52，流速为 0.9mL min-1 ，可得到良好的响应和检测灵敏度，减少并肩峰的出现;对激发波长和发射波长分别进行光谱扫描和等吸收图谱，获得最佳的Ex=340nm，Em=455nm;由于氨基酸相对分子质量差别较大，性质各异，采用梯度洗脱法可以大大提高分离效率，缩短分离周期8 .我们采用三步线性梯度洗脱程序并应用固定比率，分
16、离效果较理想，与参考文献8-11相比，分离周期大大缩短（15min） ，洗脱时间稳定，重复性好;衍生化反应的关键是必须保证 OPA 的浓度高于试样浓度的 200 倍，否则会出现非线性的响应，而且 OPA 衍生化反应不稳定，受反应时间、反应温度以及光线的影响，因此应精确地控制反应时间为 1.5min，严格控制反应 条件（28，避光）对得到合适的响应和良好的线性关系同样重要. 我们采用 OPA 为柱前衍生剂，配合优选的内标物乙醇胺，改良建立了一种适于检测此类样本中的 4 种氨基酸类神经递质的高效、稳定、简便、快捷的 HPLC 梯度洗脱分析方法.该法色谱条件简便，灵敏度高，分离周期短，对其他生物样本
17、也适用，可满足临床和科学实验的检测要求，应用前景广泛. 参考文献: 1Wan XC，Yang TZ，Xu CT.Xiandai Shenjing Shengwuxue（Modern neurobiology） M.Beijing:Beijing Yike Daxue yu Zhongguo Xiehe Yike Daxue Lianhe Chubanshe（Beijing Medi-cal UniversityChinese Xiehe Medical University United Press） ，1999:158-162，459-469. 2Ding RG，Asada H，Obata
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