1、Ri 质粒介导的毛状根技术在获得人参药用成分研究中的应用【关键词】 人参；,Ri 质粒；毛状根 【关键词】 人参； Ri 质粒；毛状根 Ri 质粒介导的毛状根技术是 20 世纪 80 年代后期，在植物细胞培养技术领域中发展起来的一项新技术。它是将发根农杆菌含有的 Ri 质粒中的 TDNA 片段整合到植物细胞的 DNA 上，诱导出毛状根，从而建立起毛状根培养系统用于次生代谢物的生产1 。由于 Ri 质粒转化的毛状根具有生长快、易于培养、有用成分高、代谢通路表达完整的特点 ，在利用生物技术生产药用植物有效成分领域，显示出极大的应用潜力和广阔的发展前景。在利用 Ri 质粒介导的毛状根技术生产人参皂苷
2、、人参多糖等次生代谢物方面已经做了大量的研究。本文就该方面的研究作一综述。1 Ri 质粒转化形成毛状根的机制37 Ri 质粒是位于发根农杆菌染色体之外的独立的双链环状 DNA，一般在 180250 kb 之间，具有 2 个非常主要的功能区：TDNA 区（Transferred DNA region）和 Vir 区（virulance region） 。农杆碱型Ri 质粒上的 TDNA 是不连续的，分为 TLDNA 和 TR-DNA。TRDNA 上带有编码农杆碱合成酶基因（ags）和生长素合成酶基因（tms1 和 tms2） ，后者指导 IAA 的合成。 发根农杆菌侵染形成毛状根的过程可分为四个
3、步骤：发根农杆菌感染植物伤口后，受伤的植物细胞合成一种特殊的小分子化合物，如酚类化合物，从而诱导 Ri 质粒的 Vir 区基因群活化；在 Vir 基因表达产生的酶的作用下，TDNA 被切下；TDNA 转移到植物细胞并整合到植物基因组 DNA；TDNA 在植物细胞中得到转录和翻译，发挥其机能，刺激植物细胞形成毛状根。 2 Ri 质粒介导的毛状根技术在获取人参药用成分研究中的应用 众多的学者已经对人参毛状根体系的建立，不同的培养基成分、菌株、诱导子对毛状根生成以及对产生次生物质的影响，人参毛状根生理生化活性，利用人参毛状根合成其他药物成分以及人参毛状根的生物反应器培养等方面进行了大量的工作，为获取
4、人参药物成分的工业化生产奠定了基础。 2.1 Ri 质粒介导的人参毛状根转化体系建立的研究 最早在 1987年，Yochikawa 等通过诱导人参的原生质体获得转化的毛状根，并首次证明人参毛状根完全有可能代替天然人参作药用。Inomata 等报道人参毛状根在培养的前两周生长很快，通过间隔一定时间更换培养基可保持毛状根的快速生长，培养 32 d 总人参皂苷含量相当于田间栽培5 年生人参根中的皂苷含量水平。刘峻等首次从人参带叶幼茎处诱导出毛状根，并证实了在转化细胞中有农杆菌 Ri 质粒 TDNA 特异的表达产物冠瘿碱。 2.2 不同发根农杆菌株、培养基及成分、植物激素和诱导子等对人参毛状根生长及药
5、效成分的影响 人参毛状根培养的最终目的是获得人参药用成分，对不同的发根农杆菌株、培养基及成分、植物激素和诱导子等条件的研究及其合理优化是提高人参毛状根生长量和药用成分的重要条件。 现有资料表明不同的菌株诱导毛状根的状况不同，刘峻等用发根农杆菌 1601、LBA918、R1000、A4 和 15834 等 5 种不同发根农杆菌感染人参，只有菌株 15834 可转化人参毛状根。赵寿经等利用 A4 菌株成功诱导了人参毛状根。而 Shu 等认为农杆菌ATCC15834 形成的毛状根中人参皂苷的产量高于农杆菌 MAFF0301724 形成的人参毛状根。由农杆菌 ATCC15834 、农杆菌 KTCT27
6、44分别转化成的毛状根，在不同的培养条件下，分别生长最好，人参皂苷的产量最高。Liu 等研究认为 Ri 质粒中 TDNA 片段中rolA、rolB 基因对毛状根中人参皂苷产量的影响很小，而 rolC 基因对人参毛状根中人参皂苷产量的提高具有重要作用。 孙彬贤等研究了由发根农杆菌 15834 诱导的人参毛状根在不同培养基上的生长和人参皂苷的含量变化，确定了最佳的培养基和培养条件。培养基中不同的元素成分也对人参毛状根皂苷的生成有重要影响。硝态氮源有助于人参毛状根中人参皂苷的生产，而氨态氮源抑制人参皂苷的生产；增加培养基中大量元素钾、镁、钙的含量或降低微量元素钴、铜、碘的含量能提高人参皂苷的产量，提
7、高锰的含量也有提高人参皂苷产量的效果 。 周倩耘等认为适宜浓度的 IAA、IBA、NAA、2，4D 植物激素，均可不同程度地促进人参毛状根的生长以及皂苷的积累，同时能影响单体皂苷的分布。刘峻等认为用 NAA、KT 和乙酰丁香酮处理可提高人参毛状根转化率并缩短转化时间。 周倩耘等研究了诱导子水杨酸（SA） 、酵母提取物（YE） 、AgNO3 和 CaCl2 对人参毛状根中皂苷含量的影响，认为诱导子可能是调节人参毛状根中皂苷积累的有效物质，而且 SA 能促进人参皂苷分泌到细胞外并在培养液中积累。刘峻等认为真菌诱导子不但能影响人参毛状根总苷的合成量，也能使某些单体皂苷消失或增加，同时也影响人参毛状根
8、的生物量，培养过程中通过外源性诱导子的添加，有利于人参毛状根次生代谢产物的定向积累。化学诱导子茉莉酮酸有显著促进人参毛状根中人参皂苷积累和提高人参皂苷 Rb 族所占比例的作用 。 2.3 人参毛状根生理生化活性的研究 刘峻等对人参愈伤组织及转化的毛状根在生长周期中 ATP 的动态含量进行测定和比较，相对人参愈伤组织，人参毛状根是分生代谢能力较强的组织，其次生代谢产物人参皂苷的合成能力也较愈伤组织强。他们又研究了人参毛状根培养过程中对 3 种重要活性氧 ROS 清除能力的动态变化，结果符合人参毛状根生长的 S 型曲线，印证了人参毛状根的生长和衰老过程 。初步验证了毛状根是一类分生代谢能力很强的组
9、织。 2.4 利用人参毛状根进行生物转化的研究 用植物培养物对外源底物进行生物转化,从而对其结构进行修饰,以获得更有意义的产物的研究报道很多,也是当今研究的热点 。 赵明强等对人参毛状根转化熊果苷的基本条件进行了初步探讨，并获得了转化产物熊果苷，栗建明等进一步对此转化产物进行了分离鉴定，认为用人参毛状根能够将氢醌转化为熊果苷。蔡洁等利用人参毛状根生物转化合成了天麻素。还有学者利用人参毛状根进行毛地黄毒苷元(digitoxigenin)和 18 甘草亭酸(18glycyrrhetinic acid)的生物转化,获得了多种酯化和糖基化产物。 2.5 人参毛状根的生物反应器培养 生物反应器培养是实现
10、工业化生产的前提。人参细胞的工业化大规模培养早在 20 世纪 80 年代已经在日本实现，人参不定根的大规模反应器培养也在韩国投产 。由于毛状根培养在植物组织和细胞培养中所具有的优势，开发人参毛状根的生物反应器培养研究将为人参药用成分的大规模工业化生产带来更大的机会。 Palazon 等进行了人参毛状根的生物反应器培养研究，认为在各种反应器中，波浪式反应器最利于人参毛状根的生长，定期补充和更新培养基以及长期培养，可以提高人参毛状根的产率和合成人参皂苷的能力。Jeong 等的实验表明，在 5 L 的生物反应器中，经过39 d 的培养，毛状根的生物量是接种时的 55 倍；在 19 L 的生物反应器中
11、，经过 40 d 的培养，毛状根的生物量是接种时的 38 倍。 3 展望 综上所述，Ri 质粒介导的毛状根技术在获得人参药用成分方面得到了大量的应用，但在基础研究方面研究的较多，且大部分研究都局限于实验室。真正能应用于工业化生产的研究还比较少，虽然有报道人参毛状根培养已开发成商品投入市场 ，但是现在在人参药材的应用上仍然以栽培为主，2004 年的栽培人参干品产量大约在 5 0005 500 吨 。而通过生物技术生产人参药用成分上占据的比例非常小。在目前状况下，大规模的种植，所带来的问题也是比较突出 。加快生物技术在获取人参药用成分中的应用，必将缓解这一系列的问题。 毛状根技术作为重要的细胞工程
12、技术之一，加快人参毛状根生成药用成分代谢途径和调控机制的研究、建立新的毛状根培养方法和毛状根大规模培养技术、研制新型的生物反应器、积极进行 Ri 质粒介导外源基因在人参毛状根中表达的研究等，将为人参毛状根技术在人参药用活性成分的工业化生产提供重要的技术支持，特别是毛状根大规模培养技术和新型生物反应器的研究将为人参药用成分的工业化生产提供广阔的前景。 参考文献 1 芮和恺.药用植物毛状根的研究和应用J.自然杂志，1997，19（1）：23 2 刘军，彭菲. Ri 质粒介导药用植物的研究进展J. 湖南中医学院学报，2004，24（3）：61 3 刘琴，吴震，翁忙玲，等.发根农杆菌质粒及其在植物科学
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