1、RT-PCR 检测穹窿海马伞切割后大鼠海马内Lhx8 mRNA 的表达变化作者：秦建兵，金国华，蒋媛媛，王 磊，朱蕙霞，田美玲，张新化【摘要】 目的：探讨切割穹隆海马伞大鼠海马与正常海马内Lhx8 mRNA 表达的差异。方法：36 只 SD 大鼠随机分成 6 组，每组 6 只。1 组为正常对照组，其余 5 组分别为切割穹窿海马伞后 3、7、14、21 和28 d 组。取各组大鼠的海马组织，提取总 RNA，采用半定量 RT-PCR 法分析穹隆海马伞切割后海马内 Lhx8 mRNA 的表达变化。结果：海马内 Lhx8 mRNA 的表达量在切割后第 3 d 开始升高，7 d 时达到最高水平，以后逐渐
2、下降，于 28 d 时恢复至正常水平。结论：切割穹窿海马伞后海马中Lhx8 mRNA 表达的增高可能与神经干细胞向胆碱能神经元分化的再生机制有关。 【关键词】 穹窿海马伞切割 海马 Lhx8 逆转录聚合酶链反应 大鼠Abstract Objective: To observe the difference of Lhx8 mRNA expression in hippocampi between the fimbria fornix transected rats and normal ones. Methods: 36 SD rats were randomly divided into 6
3、 groups, 6 rats in each group. Group one was the control group, and the others were 3rd, 7th, 14th, 21st and 28th day group after fimbria fornix transected. Then hippocampi were isolated and total RNA was extracted. Semi-quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) analysis
4、was used to detect the expressions of Lhx8 mRNA in hippocampi. Results: The expression level of Lhx8 mRNA started to increase from the 3rd day after fimbria fornix transection. The peak appeared on the 7th day, and the expression decreased slowly to pre-transection level on the 28th day. Conclusion:
5、 The increase of Lhx8 mRNA expression after fimbria fornix transected might be related to the regeneration mechanism of differentiation of neural stem cells into cholinergic neurons in hippocampus.Key words Fimbria fornix transection; Hippocampus; Lhx8; Reverse transcription-polymerase chain reactio
6、n; Rat移植于切割穹窿海马伞齿状回中的神经干细胞较正常侧海马齿状回中植入的神经干细胞更易于存活、迁移和向神经元分化1,2。体外实验也证实切割穹窿海马伞的海马提取液能明显促进神经干细胞向神经元和胆碱能分化3。这些结果提示切割穹窿海马伞后海马中某些能诱导神经干细胞存活、迁移和向神经元分化的信号物质表达增高。Lhx8 是 LIM同源盒基因家族中的一员，它主要选择性的表达在 MGE(medial ganglionic eminence, MGE)区，对于胆碱能神经元的分化有至关重要的作用4。但迄今为止 Lhx8 基因在病理模型中的表达研究仍是空白。本研究旨在观察切割穹窿海马伞后大鼠海马内 Lhx8
7、 mRNA 表达是否增高，以推测 Lhx8 与切割穹窿海马伞海马促进移植入其中的神经干细胞向神经元或胆碱能神经元分化关系。1 材料和方法1.1 实验动物 SD 大鼠 36 只（南通大学实验动物中心提供） ，雌雄不拘，体重 220250 g，随机分成 6 组，其中 1 组为正常对照组，其余 5 组分别为手术后 3、7、14、21 和 28 d 组，每组 6 只。1.2 切割大鼠穹窿海马伞 上述各手术组 SD 大鼠，经腹腔注射复合麻醉剂 Chlorpent（0.2 ml/100 g）麻醉后，固定于立体定位仪，暴露前囟，确定前囟坐标 A(矢状轴)、L(冠状轴)、V(垂直轴)，根据Paxinos 图谱
8、确定左右两侧穹隆海马伞的切割范围。先在颅骨上确定右侧两点即：（1）A1=A1.4、L1L4 和；（2）A2A1.4、L2L4；左侧两点即；（3）A3=A1.4、L3L1 和（4）A4A1.4、L4L4，每点各钻一小孔，用刀片将右侧（1）和（2） 、左侧（3）和（4）点间颅骨划开一条骨缝，将针刀插入脑内至切割深度即 V14V+5.4，来回切割 3 次，退出针刀，待无颅内出血后用骨蜡封闭骨缝，缝合皮肤，肌注青霉素，动物按性别分笼饲养。1.3 RNA 的提取和保存 正常组及手术后各组大鼠经上述方法麻醉后，断颈处死，无菌条件下剥去颅骨和硬脑膜，再去除大脑皮质和胼胝体，证实两侧穹窿海马伞被切断后，取出两
9、侧海马组织，用 Trizol法提取 RNA，沉淀用 50 l DEPC-H2O 溶解。取少量样品进行紫外定量，用甲醛变性电泳鉴定 RNA 质量，其余样品保存于70 冰箱中备用。1.4 半定量 RT-PCR 选用磷酸甘油醛脱氢酶 (glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因为内参照。反应中所用 GAPDH 上游引物为：5-ACCACAGTCCATGCCATCA C-3，下游引物为：5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3，扩增产物为 452 bp；Lhx8 上游引物为：5-ATGTATTGGAAGAGCGATCAG-3，下游引物为：5-
10、TCATTGGATGGGG TAACAAGGGC-3，扩增产物为 1102 bp。GAPDH 和 Lhx8 的 cDNA 序列查自GenBank，引物由上海英骏公司合成。PCR 反应：将目的基因与内参基因的引物置同一管内行 PCR 扩增，反应体系按试剂 DNA 聚合酶(MBI 公司)说明书操作。预变性 94 、3 min，然后 94 、45 s，60 、30 s，72 、65 s，30 个循环；最后 72 、10 min。PCR 产物经 1.2琼脂糖凝胶电泳分析，捷达图像分析系统对凝胶各泳道中的 GAPDH 和 Lhx8 条带进行光密度扫描。1.5 统计学方法 以各泳道中 Lhx8 与 GAP
11、DH 条带的光密度比值表示 Lhx8 mRNA 的相对表达量，建立相对表达量柱形图。数据输入Stata7.0 统计软件，多个样本均数的比较采用单因素方差分析，两两比较采用 q 检验（SNK 法） 。2 结 果2.1 RNA 分析 3 l RNA 样品经甲醛琼脂糖凝胶变性电泳，120 V 电压电泳 25 min，紫外灯下观察到 28 S RNA18 S RNA 约为1.51，5 S RNA 呈淡云雾状，表明样品为 RNA，且无降解。另取样品在蛋白核酸测定仪上检测 OD 值，各组 OD260/OD280 均在 1.82.0，说明所提取的 RNA 纯度较高，无污染。2.2 半定量 RT-PCR 检测
12、结果 琼脂糖凝胶电泳结果如图 1 所示，以 DL-2000 DNA Marker 为标准，扩增产物及内参大小与预期结果相符（分别为 1102 bp 和 452 bp） 。穹隆海马伞切割后不同时间点 Lhx8 mRNA 相对表达量如图 2 所示。方差分析和均数两两比较表明，切割后 28 d 组与正常对照组相比，Lhx8 mRNA 的相对表达量差异无统计学意义（P0.05)，3 d、7 d、14 d 和 21 d 组与正常对照组相比，差异均有统计学意义（P0.05)；比较切割后不同时间组，各组间的表达差异均有统计学意义（P0.05)。说明 Lhx8 mRNA 表达量自切割后第 3 d开始升高，7
13、d 时达到最高水平，以后开始下降，于 28 d 左右恢复至正常水平。3 讨 论3.1 Lhx8 基因与胆碱能神经元的发育 神经干细胞以其自我更新、增殖和多向分化潜能等特性已经成为治疗中枢神经系统损伤和退行性疾病的理想细胞材料。如何调控神经干细胞向神经元尤其是向特定表型的神经元(如胆碱能、多巴胺能等神经元)分化，已成为研究人员关注的热点和难点。Lhx84是最近新鉴定的 LIM 同源盒基因家族中的成员之一，又称为 L3、Lhx7，特异性地在胚胎基底前脑和口腔间质中表达。Zhao 等定向敲除小鼠 Lhx8 基因后发现胆碱能标记的神经元减少，从而发现 Lhx8 在胆碱能神经元的分化中起积极的作用4。M
14、anabe 等利用 RNA干扰技术发现 Lhx8 的选择性定位和它的功能性配体对于基底前脑中的胆碱能神经元的发育有重要作用5。关于 Lhx8 在病理状态下的脑组织如切割穹窿海马伞后的海马中表达的变化，以及在穹窿海马伞切割后的海马胆碱能神经元的再生中是否扮演着重要角色则尚未见有报道。3.2 切割穹窿海马伞海马中 Lhx8 mRNA 的上调可能与胆碱能神经再生有关 穹窿海马伞中不仅含有海马锥体细胞层和齿状回颗粒层细胞投射至丘脑前核、乳头体核、隔外侧核及斜角带核的传出纤维，而且还含有基底前脑内侧隔核和斜角带垂直支投射到海马的胆碱能传入纤维6,7。内侧隔核的胆碱能神经元发出纤维经海马伞和背侧穹窿这一隔
15、-海马通路与海马结构建立广泛的联系，这一胆碱能投射系统被认为与学习记忆和认知功能密切相关8。穹窿海马伞切断后，阻断了隔区等相关经穹窿海马伞投射到海马的胆碱能神经纤维，使该侧海马失去了胆碱能神经支配，导致乙酰胆碱缺失，使得海马内的微环境发生变化，而引起切割侧海马中某些物质的表达增强，而这些物质对激活自体的神经干细胞或植入的神经干细胞向神经元或胆碱能神经元分化起到了促进作用2。结合本课题组此前研究的结果，推测本实验切割侧海马 Lhx8 mRNA 的表达上调，除了可能是切割穹窿海马伞后海马中的细胞对抗损伤的一种反应外，更可能是海马中启动了胆碱能神经再生机制，是对抗海马内乙酰胆碱递质缺失后的一种反应。
16、但究竟是变化了微环境中的哪些物质，通过什么信号传导途径引起 Lhx8 mRNA 的表达上调，以及表达上调的 Lhx8 mRNA 的细胞定位等情况则还需进一步研究。【参考文献】1 金国华,张新化,田美玲,等. 大鼠海马内移植神经干细胞的存活和迁移J. 神经解剖学杂志, 2003,19(4):378-382.2 张新化,金国华,秦建兵,等. 穹窿海马伞切割侧海马对植入神经干细胞分化为神经元的影响J. 神经解剖学杂志, 2004,20(4):360-364.3 金国华,张新化,田美玲,等. 穹窿海马伞切割侧海马提取液对神经干细胞分化为神经元的促进作用J. 解剖学报, 2004,40(2):141-1
17、45.4 Zhao Y, Marin O, Hermesz E, et al. The LIM-homeobox gene Lhx8 is required for the development of many cholinergic neurons in the mouse forebrainJ. Proc Natl Acad Sci U S A，2003 ,100(15):9005-9010.5 Manabe T, Tatsumi K, Inoue M, et al. L3/Lhx8 is involved in the determination of cholinergic or G
18、ABAergic cell fateJ. J Neurochem，2005，94(3): 723-730.6 徐慧君. 神经生物学M. 苏州: 苏州大学出版社，2004: 143-158.7 朱长庚. 神经解剖学M. 上海：上海科学技术出版社, 2002:712-718.8 Xinhua Z, Guohua J, Meiling T, et al. The denervated hippocampus provides proper microenvironmet for the survival and differentiation of neural progenitorsJ. Neurosci Letter, 2007,414(2):115-120.
