1、RT-PCRSouthern 杂交法检测穹窿海马伞切割大鼠海马 Brn-4 mRNA的表达变化作者：董传明 秦建兵，金国华，王 磊，朱蕙霞，田美玲 【摘要】 目的:探讨切割穹窿海马伞大鼠海马与正常海马内 Brn-4 mRNA 表达的差异。方法：42 只 SD 大鼠随机分成正常对照组和切割穹窿海马伞后 1、3、7、14、21 及 28 d 组。取各组大鼠的海马组织，提取总RNA，采用 RT-PCR/Southern 杂交方法分析穹窿海马伞切割后海马内Brn-4 mRNA 的表达变化。结果：海马内 Brn-4 mRNA 的表达量在切割后第3 d 开始升高，14 d 达到最高水平，随后下降， 28
2、d 左右恢复至正常水平。结论：切割穹窿海马伞后海马内 Brn-4 mRNA 表达明显上调，可能与促进海马内移植的或自体的神经干细胞向神经元分化有关。 【关键词】 穹窿海马伞切割；海马；Brn-4；逆转录聚合酶链反应；Southern 杂交；大鼠Abstract Objective: To investigate the difference of Brn-4 mRNA expression between the fimbria fornix transected rats and normal ones Methods: 42 SD rats were randomly divided in
3、to 7 groups，6 rats in each groupOne group served as normal control and the others served as the 1st，3rd，7th ，14th ，21st and 28th day group after fimbria fornix transection, respectively. Then hippocampi were isolated and total RNA was extracted. RT-PCR/Southern blot was used to detect the change of
4、Brn-4 mRNA expression in hippocampus after fimbria fornix transection. Results: The expression level of Brn-4 mRNA started to increase on the 3rd day after fimbria fornix transectionThe peak appeared on the 14th day，and then the expression decreased slowly to pre-transection level on the 28th day. C
5、onclusion: The process that the expression of Brn-4 mRNA increases significantly after fimbria fornix transection, perhaps，might be related to the transplanted or endogenous neural stem cells differentiating into neurons in hippocampusKey words Fimbria fornix transection；Hippocampus；Brn-4；Reverse tr
6、anscription-PCR；Southern blot; Rat我们在近年的研究发现，将神经干细胞分别移植到切割穹窿海马伞侧海马和正常侧海马中，神经干细胞在切割侧海马中更易于存活、迁移和向神经元分化1，2。体外诱导分化发现，切割穹窿海马伞侧的海马提取液促进神经干细胞向神经元分化的作用也明显强于正常侧海马提取液3。提示切割穹窿海马伞后，海马中某些诱导神经干细胞迁移和向神经元分化的物质表达增强。 新近我们还证实切割穹窿海马伞后也能促进切割侧海马中的自体神经干细胞向神经元分化。POU 同源盒基因在中枢神经系统的发育过程中起重要作用，已证实其家族成员 Brn-4 作为重要的转录因子在胚胎纹状体神经
7、干细胞向神经元分化过程中起调控作用4。本文使用 RT-PCR/Southern 杂交方法观察了切割穹窿海马伞后不同时间点大鼠海马 Brn-4 mRNA 表达量的变化，以期阐明 Brn-4 的表达变化与海马中植入的或自体的神经干细胞向神经元分化的相关性。1 材料和方法1.1 实验动物及分组 SD 大鼠 42 只(南通大学实验动物中心提供)，雌雄不拘，体重 220250 g，随机分成 7 组，其中 1 组为正常对照组，其余 6 组分别为切割穹窿海马伞术后 1、3、7、14、21 和 28 d 组，每组 6 只。1.2 切割大鼠穹窿海马伞 上述各组大鼠，经腹腔注射复合麻醉剂 Chlorpent(0.
8、2 ml/100 g)麻醉后，固定于立体定位仪，暴露前囟，确定前囟坐标 A(矢状轴)、L(冠状轴)、V(垂直轴)，根据 Paxinos 图谱确定左右两侧穹窿海马伞的切割范围。先在颅骨上确定右侧两点即(1)A1=A-1.4、L1=L-4 和(2)A2=A-1.4、L2=L-4；左侧两点即(3)A3=A-1.4、L3=L+1 和(4)A4=A-1.4、L4=L+4，每点各钻一小孔，用刀片将右侧(1)和(2)、左侧(3)和(4)点间颅骨划开一条骨缝，将针刀插入脑内至切割深度即 V14=V+5.4，来回切割 3 次，退出针刀，待无颅内出血后用骨蜡封闭骨缝，缝合皮肤，肌注青霉素，动物按性别分笼饲养。1.
9、3 RNA 的提取 正常对照组及术后各组大鼠经上述方法麻醉后，断颈处死，无菌条件下剥去颅骨和硬脑膜，再去除大脑皮质和胼胝体,证实两侧穹窿海马伞被切断后,取出两侧海马组织,置匀浆器中,加入1ml Trizol(BBI 公司)充分匀浆，提取 RNA。测 OD260/280 值，经甲醛变性电泳鉴定 RNA 质量，-70保存备用。1.4 RT-PCR 选用磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因为内参照。反应中所用 Brn-4 上游引物为：5-GGGTGACCAGTCTTAGCGAC-3，下游引物为：5-GCGAGTACACATT
10、GAGGGGT-3，扩增产物为 237 bp；GAPDH 上游引物为：5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3，下游引物为：5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3，扩增产物为 452 bp。 （1）逆转录：使用逆转录试剂盒(BBI 公司)，以所提取的 RNA 为模板逆转录得到 cDNA；（2）PCR 反应：将目的基因与内参基因的引物置同一管内行 PCR 扩增，反应体系按试剂 DNA 聚合酶(MBI 公司)说明书操作。预变性 94，3 min，94，40 s、54，30 s、72，45 s，32 个循环；最后延伸 72，10 min；（3）琼脂糖凝胶电泳及半定量分析：取 PCR
11、 扩增产物 10 l 和PCR Marker(TaKaRa 公司 DL2000)5 l ，加样于 1.5 琼脂糖凝胶加样孔内(含 0.5 mg/L 溴化乙啶)，置 0.5TBE 电泳缓冲液中，8 V/cm 电压电泳 30 min 后观察结果。1.5 合成探针 参照 GenBank 设计分别与目的基因和内参基因杂交的 DNA 探针，委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成，探针序列如下。与目的基因杂交的探针序列为：5-GGAGCAATCATCCATCACCGCTCGCCTCACGTAGC-3，5端为地高辛(DIG)标记；与内参基因杂交的探针序列为：5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3
12、，5端为地高辛(DIG)标记。1.6 Southern 杂交鉴定46 RT-PCR 产物用向下毛细血管法7转移至 Hybond-N+尼龙膜(Amresco 公司)上，与用上述方法标记的目的基因和内参基因探针杂交，化学发光法观察结果。操作方法依照 DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit （Roche 公司）说明书进行。1.7 统计学分析 X 胶片呈像后，用捷达图像分析系统对 Brn-4 RT-PCRSouthern 杂交条带和 GAPDH RT-PCR/Southern 杂交条带进行光密度扫描。以各组 Brn-4 与 GAPDH
13、 RT-PCR/Southern 杂交条带的光密度比值表示 Brn-4 mRNA 的相对表达量，建立相对表达量柱形图。数据输入 STATA70 统计软件，多个样本均数的比较用单因素方差分析，均数两两比较用 q 检验(SNK 法)。2 结 果2.1 目的基因探针敏感性检测 结果见图 1，对其进行灰度扫描，并进行图像处理分析。已知标准探针浓度为 1 ng/l，根据各稀释度待测探针和标准探针的灰度比较，估测探针浓度约为 300 pg/l。2.2 内参基因探针敏感性检测 结果见图 2，对其进行灰度扫描, 并进行图像处理分析。已知标准探针浓度为 1 ng/l，根据各稀释度待测探针和标准探针的灰度比较，估
14、测探针浓度约为 400 pg/l。2.3 RT-PCRSouthern 杂交检测结果 穹窿海马伞切割后不同时间点 RT-PCR/Southern 杂交检测 Brn-4 mRNA 含量如图 3 所示，Brn-4 mRNA 相对表达量如图 4 所示，方差分析和均数两两比较表明，切割后l、28 d 组与正常对照组相比，Brn-4 mRNA 的相对表达量差异无 x 统计学意义（P0.05） ，3、7、14 和 21 d 组与正常对照组相比，差异均有统计学意义（P0.05） ；比较切割后不同时间组，除 1 d 组与 28 d 组间的差异无统计学意义外，其余各组间的表达差异均有统计学意义，说明 Brn-4
15、 mRNA 表达量自切割后第 3 d 开始明显升高，14 d 时达到最高水平，以后开始下降，于 28 d 左右恢复至正常水平。3 讨 论研究表明, 神经干细胞具有分裂、增殖特性和多分化潜能8，9，这将使神经干细胞有可能成为治疗中枢神经系统损伤和神经系统退行性疾病的理想细胞材料。但影响神经干细胞分化为神经元的因素十分复杂，目前的研究发现大部分神经干细胞分化成了胶质细胞，仅少数分化为神经元10，因此调控神经干细胞向神经元或特定表型神经元的定向分化研究具有重要的理论意义和应用价值。同源盒基因在中枢神经系统发育过程中扮演着重要角色11，如POU 家族、LIM 家族等，它们的产物，作为转录因子参与体内一
16、些与发育相关基因表达的调控12。有研究观察到，脑源性神经营养因子在刺激胚胎纹状体神经干细胞向神经元的分化过程中，Brn-4 表达显著上调；应用 Brn-4 的反义寡核苷酸则可明显阻断其向神经元分化4。Le Moine 等13发现，阻断来自黑质的多巴胺能神经纤维向纹状体的投射，可引起纹状体内 Brn-4 的表达上调。上述的研究均提示，Brn-4 不但具有介导发育中的纹状体神经元分化的作用，而且与成年哺乳类动物去多巴胺能神经支配后纹状体内的神经再生和修复相关。本实验通过 RT-PCR/Southern 杂交方法观察到切割穹窿海马伞后，海马组织内 Brn-4 mRNA 表达在第 14 d 明显上调,
17、再一次验证了本课题组此前用 RT-PCR 方法做的结果。结合本课题组此前切割穹窿海马伞侧的海马微环境变化可以促进移植于其中的神经干细胞向神经元分化的研究13，以及最近我们证实切割穹窿海马伞后也能促进切割侧海马中的自体神经干细胞向神经元分化等的研究，推测切割穹窿海马伞阻断了隔区胆碱能神经向海马的投射及损伤了穹窿海马伞中的海马传出纤维，海马中某些表达增强的物质可能通过诱导神经干细胞 Brn-4 表达上调，进而向神经元分化，这在某种程度上激活了机体内的再生机制，使机体具有自我修复的可能。Calza 等14用 192IgG-saporin 特异性去除前脑的胆碱能神经元，然后在侧脑室中施加 NGF，结果
18、在海马中发现了再生的胆碱能神经元，就推测这些胆碱能神经元是由海马内自体神经干细胞增殖和分化而来。目前国内外对 Brn-4 及其他 POU 家族转录因子的下游基因研究甚少，尤其对与神经干细胞分化相关的下游基因所知更少，所以在这方面还有待进一步研究。【参考文献】1 金国华，张新化，田美玲，等大鼠海马内移植神经干细胞的存活和迁移J 神经解剖学杂志, 2003,19(4):378-3822 张新化，金国华，秦建兵，等穹窿海马伞切割侧海马对植入神经干细胞分化为神经元的影响J神经解剖学杂志，2004，20(4):360-364.3 金国华，张新化，田美玲，等穹窿海马伞切割侧海马提取液对神经干细胞分化为神经
19、元的促进作用J解剖学报，2004，40(2):141-1454 Shimazaki T，Arsenijevic Y，Ryan AK， et a1A role for the POU transcription factor Brn-4 in the regulation of striatal neuron precursor diferentiationJEMBO J，1999，18(2)：444-4565 智 慧, 詹 俊, 邓庆丽 ,等. RTPCRSouthern 杂交方法检测肝癌患者外周血 AFP mRNA J胃肠病学和肝病学杂志，2001，10(4):324-327.6 李 红，肖
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