1、SiRNA 逆转肺耐药相关蛋白表达介导的白血病细胞多药耐药【摘要】 目的：研究双链短干扰 RNA（siRNA）对白血病多药耐药细胞模型（K562/NaB）肺耐药相关蛋白（LRP）表达及功能的影响. 方法： 针对 LRP 基因设计合成特异性 siRNA，在脂质体介导下转染K562/NaB；采用半定量逆转录聚合酶链反应（RTPCR ）检测 K562 细胞LRP mRNA 的水平；用流式细胞术检测 K562/NaB 细胞 LRP 蛋白表达的变化和细胞内柔红霉素（DNR）的蓄积；MTT 法检测阿霉素（ADM）对K562/NaB 细胞耐药的半数抑制浓度（IC50）. 结果： siRNA 转染后：K562
2、/NaB 细胞的 LRP mRMA 水平明显降低；LRP 蛋白表达由阳性转为阴性；细胞内 DNR 的蓄积明显增加，DNR 平均荧光增强 3.28 倍；对 ADM 药物敏感相对逆转效率为 78.18%. 结论： siRNA 可逆转由 LRP 介导的白血病细胞多药耐药. 【关键词】 RNA，小分子干扰；基因，肺耐药相关蛋白；K562 细胞；抗药性，多药 【Abstract】 AIM: To investigate the effect of short interfering RNA (siRNA) on expression and function of lung resistancerela
3、ted protein (LRP) in the multidrug resistant human leukemia cells (K562/NaB). METHODS: Multidrugresistant K562 cells with high level LRP expression treated with sodium butyrate (NaB), was used as an in vitro model system. LRP specific siRNA was synthesized and transfected into the K562/NaB cells. Ex
4、pression of LRP mRNA was detected by reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RTPCR), and protein level and intracellular daunorubicin (DNR) accumulation in K562/NaB cells were detected by flow cytometry. 50% inhibition concentration (IC50) of adriamycin (ADM) on K562/NaB cells was detected b
5、y MTT method. RESULTS: LRP mRNA level was decreased obviously; the protein expression was turned from positive result to negative result. Intracellular DNR accumulation was increased and the mean fluorescence of DNR was 3.28 times higher. The relative efficiency to ADM was 78.18. CONCLUSION: The siR
6、NA could effectively reverse the multidrug resistance of leukemia cells induced by LRP. 【Keywords】RNA, small interfering; gene, lung resistancerelated protein; K562 cells; drug resistance, multiple 0 引言 肺耐药相关蛋白（lungrelated resistant protein， LRP）是一种新型的与多药耐药（multidrug resistance， MDR）相关的糖蛋白，主要导致细胞内药物
7、聚集缺陷，而在多种肿瘤细胞内引起 MDR. 在儿童白血病以及成人髓系白血病（AML）中，LRP 表达是独立的预后决定因素之一，其过度表达造成患者对化疗不敏感，提示预后不良1-2. 双链短干扰 RNA（short interfering RNA， siRNA）介导的 RNA 干扰（RNA interference， RNAi） ，是在特异性抑制哺乳动物细胞基因方面的最新突破3-4. 我们在建立了经丁酸钠（sodium butyrate， NaB）诱导人 AML 系 K562 细胞，高表达 LRP 并介导多药耐药的细胞模型（K562/NaB）的基础上5 ，设计合成了 LRP 特异性 siRNALR
8、P ，并转染上述细胞模型，观察 siRNALRP 抑制 LRP 基因和蛋白表达、消除 LRP改变细胞内药物蓄积和分布作用的效果，以期为逆转 LRP 介导的肿瘤细胞 MDR、提高儿童难治性和复发性白血病化疗效果探索新的方法，并探讨以 siRNA 介导的 RNAi 用于肿瘤细胞 MDR 治疗的可行性. 1 材料和方法 1.1 材料 AML 细胞系 K562 细胞购自中国科学院上海细胞生物研究所；单克隆抗体 LRP56 为 Monosan 公司产品；固定和破膜试剂盒、藻红蛋白（phycoerythrin，PE）荧光标记羊抗鼠 IgG 抗体为 Caltolog Laboratories 产品；NaB
9、为 Sigma 公司产品. LRP 特异性短干涉 RNA(siRNALRP) 自行设计，由 Dharmacon 公司合成. 浓度 20 mmol/L，序列：5 GCU CUU UUC AGU GCC AGA C dTdT （正义链） ，dTdT CGA GAA AAG UCA CGG UCU G 5 （反义链）. 1.2 方法 1.2.1K562 细胞培养和高表达 LRP 的 K562 多药耐药细胞模型（K562/N） 10K562 细胞在含 100 mL/L 小牛血清的 RPMI 1640 培养基于 37, 50 ml/L CO2 条件下培养. K562 细胞在含 2 mmol/L NaB
10、的培养液中处理 3 d，制作 K562 细胞高表达 LRP 的多药耐药细胞模型，命名为 K562/NaB. 阴性对照组不加 NaB. 1.2.2siRNA 转染 实验 K562/NaBsiRNA 组：取 K562/NaB 细胞接种于 24 孔板内，每孔 500 L，浓度为 3108/ L. 分别以无血清 RPMI 1640 培养液 50 L 稀释 siRNALRP, Lipofectamine 各 1 L，混匀静置后加入细胞悬液. 再加入 NaB 使终浓度为 2 mmol/L，进行细胞培养. 每 24 h 以含 2 mmol/L NaB 的 RPMI 1640 培养基 500 L 换液，连续
11、3 d. 转染后 24, 48, 72 h 分别取细胞进行相关检测. K562/NaBH2O 组：取 K562/NaB 细胞，以无 RNase 水代替siRNALRP 转染细胞，操作方法、实验条件同 siRNA 转染组. 取转染 72 h 细胞进行检测. 对照组： K562/NaB 细胞作为阳性对照；原始的 K562 细胞作为阴性对照. 1.2.3RTPCR 方法检测 K562 细胞 LRP mRNA 水平同时取实验和对照组细胞各 1106，以Trizol 提取总 RNA，以 RTPCR 检测 LRP mRNA 水平. 反转录以 Oligo(dt)15 作为引物，37 1 h. PCR 引物：
12、LRP 上游引物： 5GAT CCG ACC AGT CAG AAG CCG AG3 ，下游引物：5AAT TCA CTT CTT CAC CTC CAC CTC AGC C3 ，扩增产物 300 bp. 内对照 GAPDH 上游引物：5AAT CCC ATC ACC ATC TTC CA3 ，下游引物： 5CCT GCT TCA CCA CCT TCT TG3 ，扩增产物 590 bp. 扩增条件：95 1 min，然后按 94 40 s, 58 45 s, 70 45 s，循环 30 次，最后以 72 10 min 结束反应. RTPCR 产物电泳，LRP 条带和 GAPDH 条带吸收峰比
13、值LRP/GAPDH0.3，视为 LRP mRNA 表达阳性. 1.2.4 流式细胞术检测 K562 细胞 LRP 蛋白表达以 LRP 的单克隆抗体 LRP56 为一抗，PE 标记的羊抗鼠 IgG 为二抗，标记各组 K562 细胞，在流式细胞仪上检测其 LRP蛋白的表达情况. 同时取实验和对照组的细胞各 1106，依次加入前固定液、打孔剂和 LRP56 单抗混合物、PE 标记羊抗鼠 IgG，避光保存. 各步骤间以含 1 ml/L 叠氮钠、100 ml/L 小牛血清的 PBS 洗涤细胞 2 次. 标记 4 h 内上流式细胞仪检测 LRP 蛋白表达，LRP 阳性细胞5%视为阳性结果. 1.2.5
14、流式细胞术检测 细胞内柔红霉素（daunorubicin, DNR）蓄积同时取K562/NaBsiRNA 组转染 72 h 的细胞、K562/NaBH2O 组和阳性对照、阴性对照细胞各 2106，在含 100 mL/L 小牛血清的 RPMI1640 培养基中调整细胞浓度为 1109/L，加入 DNR 使终浓度为 1 mol/L，于 37, 50 mL/L CO2,饱和湿度条件下培养 2 h. 洗涤后立即以流式细胞仪 FL 2通道在相同条件下随机检测 10 000 个细胞. 以不加 DNR 的 K562 细胞作为空白对照. 1.2.6MTT 法检测 ADM 的 IC50 同时取 K562/NaB
15、siRNA 组转染 72 h 的细胞、K562/NaBH2O 组和阳性对照、阴性对照细胞，调整细胞浓度至1108/L，在 96 孔板的各孔中加入 180 L 细胞和不同浓度（0.1 g 100.0 g）的 ADM，培养 72 h 后每孔加入 20 L 5 g/L 的 MTT，继续孵育 4 h，570 nm 波长处测定吸光度（A）值. 按以下公式分别计算相对逆转效率. 相对逆转效率=（IC50A- IC50B）/（IC50A-IC50C）. 其中IC50A 是 K562/NaB 细胞的 IC50，IC50B 是转染 siRNA 的 K562/NaB 细胞的IC50，IC50C 是 K562 细胞
16、的 IC50. 统计学处理：采用 2 检验和 OneWay ANOVA 检验. P0.05 认为具有统计学意义. 2 结果 2.1K562/NaB 细胞 LRP mRNA 水平的变化 K562/NaBH2O 组、阴性对照、阳性对照 LRP mRNA 表达阳性，其中阴性对照 LRP/GAPDH 0.53，H2O 转染组、阳性对照 LRP/GAPDH 分别为0.96, 0.98，较阴性对照明显升高. K562/NaBsiRNA 组中，转染 24, 48, 72 h, LRP mRNA 检测均为阴性，较 K562/NaBH2O 组、阳性对照、阴性对照明显减低（图 1）. 2.2K562/NaB 细胞
17、 LRP 蛋白表达的变化 K562/NaBsiRNA 组转染 48 h 和 72 h 的细胞、阴性对照细胞 LRP 表达阴性；K562/NaBsiRNA 组转染 24 h 的细胞、H2O 转染组、阳性对照LRP 表达阳性. 当阴性对照 LRP 阳性率为 1.77%时，K562/NaBH2O 组、阳性对照 LRP 阳性表达率分别为 36.11%和 35.10%，后二者 LRP 表达无明显差异（P0.05） ；K562/NaBsiRNA 组中，转染 24 h, 48 h, 72 h后，LRP 阳性率分别为 14.98%, 1.39%和 1.55%，转染 24 h 后 LRP 表达较K562/NaB
18、 H2O 组、阳性对照明显减少（P0.01） ；转染 48, 72 h 后，LRP 阳性表达较转染 24 h 明显减少（P0.01）. 2.3DNR 在 K562/NaB 细胞内蓄积的变化 加入 DNR 的实验组细胞出现明显的荧光，未加入 DNR 的空白对照K562 细胞检测到微弱荧光（平均荧光强度为 4）. K562/NaBH2O 组和阳性对照细胞内 DNR 平均荧光强度分别为 38 和 36；阴性对照 K562 细胞平均荧光强度为 115；K562/NaBsiRNA 组转染 72 h 的 K562 细胞内 DNR 平均荧光强度为 118，较 K562/NaBH2O 组细胞内 DNR 平均荧
19、光强度增强了3.28 倍(图 2). 2.4K562/NaB 细胞药物敏感性的变化 siRNALRP 作用 72 h 后的 K562/NaB 细胞对 ADM 的敏感性增加，药物敏感相对逆转效率为 78.6%（表 1）. 表明 siRNALRP 可以恢复K562/NaB 细胞对化疗药物的敏感性. 表 1siRNAs 对 ADM 作用于 K562/NaB细胞的 IC50 的影响（略） 3 讨论 在多种生物中，外源双链 RNA（double stranded RNA, dsRNA）导入细胞中，与其同源的 mRNA 受到降解，其相应基因受到抑制，称为 RNA 干涉（RNA interference,
20、RNAi） 6-8. 研究表明9-10 ，体外合成的小分子 dsRNA 能直接触发 RNAi，这些小分子 dsRNA 被称为小干涉RNA（small interfering RNA） ，即 siRNA. siRNA 介导 RNAi 的机制主要由 RNAi 核酸酶催化，该酶包括一个 dsRNA 结合区，一或多个 RNA 酶区域，以及一个 RNA 解旋酶区域. 首先 dsRNA 与 RNA 核酸酶结合，并被分解成为的 2123nt 的 siRNA，与该酶稳定结合形成 360 kDa 的蛋白质RNA复合体. siRNA 特异地与同源 mRNA 结合，解旋酶区域催化 mRNA 与 siRNA的正义链交
21、换. 最终 mRNA 被降解，并再生成 siRNA 与 RNAi 核酸酶的复合体. 目前，RNAi 技术以其高效性、特异性，在基因沉默中得到广泛应用，对于肿瘤细胞多药耐药基因的消除是其应用的热点之一. 我们设计合成了针对 LRP 的特异性 siRNA，用以转染 K562 细胞高表达 LRP 的细胞模型，初步探讨特异性 siRNA 降解 LRP 的 mRNA、降低 LRP蛋白的表达的作用、消除 LRP 的药泵功能的效果. 本研究的发现，以siRNALRP 转染 NaB 诱导 3 d 的 K562 细胞，转染 24 h，LRP mRNA 水平明显下降，转为阴性；LRP 蛋白水平明显下降；转染 48
22、 h, 72 h, LRP LRP mRNA 和 LRP 蛋白表达仍均为阴性. 在 LRP 改变细胞内化疗药物蓄积和对化疗药物耐药性方面，经 siRNALRP 转染 72 h，K562/NaB 细胞内DNR 蓄积增加，恢复到原始的 K562 细胞水平，对 ADM 的耐药性明显降低. 上述结果表明，siRNALRP 能够有效降解 K562 细胞 LRP mRNA，使LRP 蛋白表达受到抑制，并因此消除了 LRP 介导的 MDR 作用，因此有望成为逆转 LRP 介导肿瘤细胞 MDR 的有效方法. 【参考文献】 1List AF, Spier CS, Grogan TM, et al. Overex
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