1、shRNA 介导的 RNAi 载体构建及对肝癌耐药细胞 MDR1 基因表达的抑制作者：秦维超 张有顺 周新 胡礼仪 【摘要】 目的： 重组构建抑制多药耐药 MDR1 基因表达的 shRNA真核表达载体，研究其对肝癌耐药细胞 MDR1 基因表达的抑制作用，以及对 P 糖蛋白（Pgp ）表达和功能的抑制作用. 方法： 根据 MDR1 基因序列，设计两段 21 个碱基的 MDR1 特异性靶序列作为 shRNA 目标序列（shMDR11 ，shMDR12 ） ，重组构建 pshMDR1 表达质粒. 采用脂质体介导转染肝癌耐药细胞 SMMC7721/R ，用 MTT 法测定细胞对化疗药物阿霉素（ADM）
2、的敏感性，流式细胞仪检测细胞膜表面 P 糖蛋白（Pgp ）表达和细胞内 Rhdaming123（Rh123）的潴留. 结果： PCR 和DNA 测序证实了 pshMDR11 和 pshMDR12 重组质粒的成功构建，均能有效地抑制细胞 Pgp 表达；转染细胞后均能够一定程度地恢复耐药细胞对化疗药物 ADM 敏感性，Pgp 表达水平明显降低，细胞内的 Rh123稳态积累量均明显增高；第 1 条序列更能有效的抑制 MDR1 基因表达. 结论： 体外完成 shRNA RNAi 载体的构建，能有效地逆转肝癌耐药细胞MDR1 基因过度表达，抑制 Pgp 介导的多药耐药. 从 DNA 载体产生的shRNA
3、 在肝癌耐药细胞内能诱导 RNAi，能够序列特异性地抑制 MDR1 基因表达. 【关键词】 RNA 干扰；抗药性，多药；短发夹 RNA；重组，遗传；质粒；基因表达 【Abstract】 AIM: To construct a recombinant plasmid generating short hairpin RNA(shRNA) containing multidrug resistance gene MDR1 segment in mammalian cells and to investigate its suppression on MDR1 mRNA and Pglycoprot
4、ein(Pgp) expressions in hepatocellular carcinoma cells. METHODS: Based on the design of two fragments of oligonucleotides for shRNA expression which targeted MDR1 gene (shMDR11, shMDR12), RNAi plasmids (pshMDR1)were constructed and transfected into SMMC7721/R cells by LyoVecTM. Drug sensitivity was
5、measured by MTT assay, Pgp expression and intracellular Rh123 accumulation were determined by flow cytometry(FCM). RESULTS: Recombinant pshMDR1 vectors were identified by PCR and confirmed by sequencing analysis. They could suppress Pgp expression in hepatocellular carcinoma cells. Drug sensitivity
6、was increased significantly after pshRNAMDR1 was transfected in SMMC7721/R cells. The level of Pgp expression was reduced significantly. The intracellular accumulation of Rh123 was increased greatly after pshMDR1 treatment in SMMC7721/R cells. The shMDR11 was more effective in the suppression of MDR
7、1. CONCLUSION: Recombinant pshMDR1 vector can suppress the expressions of MDR1 mRNA and Pgp in SMMC7721/R cells. The inhibitory effect of the shRNA generated from the DNA vector is highly related to the target sites and to the different cell lines. 【Keywords】 RNA interference; drug resistance, multi
8、ple; short hairpin RNA; recombination, genetic; plasmids; gene expression 0 引言 肿瘤化疗失败的重要原因之一是肿瘤产生多药耐药（multi drug resistance, MDR）. 多药耐药基因 MDR1 基因的过度表达是导致肿瘤细胞产生耐药的重要机制1-2. RNA 干扰（RNAi）是新近发展起来的一种封闭基因表达的有效方法，它通过将双链 RNA（dsRNA）导入细胞后，在 Dicer 酶的作用下产生有活性的小干扰 RNA（siRNA） ，使与该段 RNA 同源的目的 mRNA 产生特异性降解，从而导致特异基因表
9、达抑制的转录后基因沉默现象3-4. 本实验我们运用 PGE1 载体，构建了含多药耐药基因（MDR1）的短发夹状 RNA（shRNA）真核表达载体，观察其对肝癌耐药细胞株 SMMC7721/R 的 MDR1, P 糖蛋白（Pgp ）表达的抑制作用. 1 材料和方法 1.1 材料 肝癌细胞株 SMMC7721 为同济医科大学免疫教研室沈关心教授惠赠，本研究所传代培养. SMMC7721/R 细胞由本室用阿霉素对其敏感细胞株诱导成功后冻存. 宿主菌大肠埃希氏菌 SCS1, PGE1 质粒及 PGE1 阴性对照质粒（shneg ）, TaqDNA 聚合酶,T4DNA 连接酶和 MgCl2 均购自Pro
10、mega 公司，限制性内切酶 BamHI 和 XbaI 购自 MBI 公司，低熔点琼脂糖购自 Gibco 公司，小量质粒提取试剂盒和回收质粒纯化试剂盒均购自上海申能博彩公司. 转染试剂 LyoVecTM 为 InvivoGen 公司产品，抗Pgp 抗体为 NeoMarkers 产品，FITC 标记的羊抗鼠 IgG 为 KPL 产品，罗丹明 123（Rh123）和四甲基偶氮唑盐（MTT）为 Sigma 公司产品. 1.2 方法 1.2.1 引物的设计针对质粒 PGE1 序列，利用引物设计软件设计PCR 引物序列，Forward：5CGT CGA TTT TTG TGA TGC TCG TCA G
11、3 ，Reverse：5GAA GCA TTT ATC AGG GTT ATT GTC TCA TG3. 根据 GeneBank 中的 MDR1 mRNA 序列设计 MDR1 引物 1：5 CAGGAGATAGGCTGGTTTGATGGT3 ，引物 2：5 TTAGCTTCCAACCACGT GTAAATC3 ，其产物为 172 bp；引物和 DNA 片段由上海生工有限公司合成. 1.2.2 重组质粒的构建与鉴定 1.2.2.1 shRNA 的设计与合成按照 shRNA 的设计原则5 ，根据GeneBank MDR1 基因已知序列，选取 2 段含 21 nt 的 MDR1 特异性靶序列作为 s
12、hRNA 目标序列（shMDR11 ： GGA GGC CAA CAT ACA TGC CTT；shMDR12 ： GAT CGC TAC TGA AGC AAT AGA） ，在 GeneBank 数据库进行同源序列搜索，以证明其特异性. 合成该目的序列的反向互补序列，中间通过 8 nt 的回折序列（GAAGCTTG）将此两段序列相连，形成茎环结构，3端添加 5 个 T，作为 RNA 聚合酶的终止子，形成 62 nt的寡核苷酸正义链. 1.2.2.2 pshRNAMDR1 重组质粒的构建合成 2 对 62 nt 寡核苷酸链，溶解在 ddH2O 中，终浓度为 0.2 g/L. 正义链和互补链的
13、Oligos 退火形成双链 DNA（dsDNA） ，分别与经过酶切回收后的 PGE1 线性载体连接，得到重组质粒，命名为 pshRNAMDR11 和 pshRNAMDR12. 转化感受态细胞，37培养过夜筛选，获得阳性转化子菌落. 1.2.2.3 重组质粒的鉴定挑选阳性转化菌落扩增，提取质粒. 用PCR 方法初步鉴定，同时设计未带插入片段的 PGE1 质粒作为对照. 扩增条件：94变性 3 min；94变性 30 s，55退火 30 s，72延伸 1 min，35 个循环后，72延伸 5 min. 取 PCR 产物和 DNA Marker 经 50 mol/L 的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定. 提取
14、重组质粒，送大连宝生物工程技术服务有限公司进行序列测定. 1.2.3 细胞转染培养调整细胞 11011/L，接种于 6 孔板，培养： 100 mL/L 小牛血清, 37, 50 mL/L CO2；待细胞贴壁至 80%汇片后，换入无血清 RPMI1640 培养基，同时分别加入 AB 混合液（A 液： 一定量 20 L 的重组质粒稀释于 100 L 无血清 RPMI 1640 中；B 液：25 L 脂质体稀释于 100 L 无血清 RPMI 1640 中，混合 AB 液. ）置室温孵育 30 min，培养 5 h 后加小牛血清终止转染，24 h 后换完全培养基，然后培养不同时间备用. 同时设立 P
15、GE1 阴性对照质粒（shneg ）转染组. 1.2.4 重组质粒在细胞内表达 MTT 法检测细胞对 ADM 药物敏感性，各试验组细胞转染 24 h 后，取对数生长期细胞（包括试验组，对照组） ，调整细胞浓度为 11011/L. 接种于 96 孔板，加入不同浓度的 ADM，置50 mL/L CO2, 37培养箱中孵育 48 h 后. 加入 MTT 10 L（5 g/L） ，继续培养 4 h 后弃培养上清液，加入 DMSO，振摇 10 min 后，570 nm 测出吸光度值. 每个浓度组平行 4 孔，取平均值，计算细胞存活率（90%）A 实验组/A 对照组100%，以药物浓度为横轴，细胞存活率为
16、纵轴绘制浓度效应曲线，求出回归方程，确定半数抑制浓度（IC50）. 耐药指数（resistance index，RI）= 实验组 IC50/亲本细胞 IC50. 1.2.5 用 FCM 检测质粒转染后细胞表面膜蛋白 Pgp 表达各试验组转染细胞 72 h 后，胰酶消化，调整最终浓度 11011/L，混匀细胞. 20 g/L 甲醛室温固定 20 min，冷 PBS 洗涤 2 次，加入 Pgp 抗体，4孵育2 h；混匀细胞，PBS 洗 2 次，加入 FITC 标记的羊抗鼠 IgG，室温避光孵育 30 min. PBS 洗涤后，立即用流式细胞仪检测. 相同处理组平行 5 孔，以未经处理的 SMMC7
17、721/R 细胞为空白对照. 1.2.6 FCM 检测转染后细胞内 Rh123 的潴留各实验组转染细胞 72 h后，用 PBS 洗 2 遍. 加入 Rh123（0.2 mg/L） ，37培养箱中共孵育 45 min. 冷的 PBS 洗 2 遍. 胰酶消化各组细胞，调整最终浓度 1109/L，在30 min 内用流式细胞仪测细胞内 Rh123 的强度. 统计学处理： 数据均采用 xs 表示，运用 SPSS12.0 统计软件对数据进行单因素方差分析（oneway ANOVA） ，组间比较利用 LSD 法检测其差异性，判断标准以 P0.05 为有统计学显著性差异. 2 结果 2.1 shRNA 真核
18、表达载体的构建及鉴定未带插入片段的 PGE1 质粒扩增产物电泳结果在 605 bp 处，插入 62 nt 的 pshRNA MDR11 和pshRNAMDR12 重组质粒的扩增产物在 652 bp 处，其电泳结果与实验预计的结果完全相符（图 1）. 重组质粒的测序结果与设计合成的shMDR1 靶向目标序列完全一致，证明把合成的 62 nt 的寡核苷酸插入到了 RNAi 载体 PGE1 中的预计位点，且序列完全一致. 2.2 MTT 法检测各组细胞药物敏感性 SMMC7721/R+shneg 与SMMC7721/R 细胞组相比较，差异无显著性（P0.05）. SMMC7721/R+shMDR11
19、, SMMC7721/R+shMDR12 细胞组分别与SMMC7721/R 细胞组相比较，IC50 明显降低，有显著性差异（P0.05） ；比较 pshMDR11 和 pshMDR12 质粒在细胞内表达同样存在显著性差异（P0.05）. 以上表明重组构建的质粒转染细胞后均一定程度地恢复耐药细胞对化疗药物 ADM 敏感性(表 1).表 1shRNA对 SMMC7721/ADM 细胞 IC50 的影响（略） 2.3 Pgp 表达水平变化 pshMDR11 和 pshMDR12 重组质粒转染 MMC7721/R 细胞后，细胞膜表达 Pgp 分别为（45.76.3）%和（60.04.5）%，与SMMC
20、7721/R 细胞（91.35.3）%比较，有显著性差异（P0.05） ；pshMDR11 和 pshMDR12 重组质粒转染细胞后，在细胞内 Pgp 表达同样存在显著性差异（P0.05）. 表明重组构建 pshMDR1 质粒转染细胞后，在细胞内可以逆转 MDR1 基因过度表达 Pgp ，并且两段序列分别所诱导的 RNAi 效果也具有显著性差异（P0.05）. 2.4 Pgp 功能检测重组质粒转染细胞 48 h 后，流式细胞仪检测细胞内的 Rh123 积累量分别为：（73.05.2）%, （56.13.2）%，未转染 SMMC7721/R 细胞 Rh123 积累量为：（24.52.6）%；SM
21、MC7721/R+shMDR11 ，MMC7721/R+shMDR12 与SMMC7721/R 细胞内的 Rh123 积累量比较，存在显著差异（P0.05） ；但与敏感株细胞内的 Rh123 积累量（98.61.2）%相比，其细胞内的Rh123 积累量还是相对较低，存在显著差异（P0.05） ；pshMDR11 和 pshMDR12 质粒转染细胞后，细胞内的 Rh123 的潴留也有显著性差异（P0.05）. 3 讨论 Pgp 是一种 ATP 依赖跨膜药物外流泵，将细胞内多种 MDR 相关药物泵出细胞外，导致肿瘤细胞内药物浓度下降而不能杀伤肿瘤细胞，为临床肿瘤化疗失败的主要原因6. 因此，研究产
22、生 MDR 现象的机制及克服 MDR 现象的方法为提高肿瘤化疗效果的主要途径之一，已成为重要的研究课题. 研究肿瘤细胞 MDR 的一个重点是耐药性的逆转，已发现多种药物有逆转 MDR 的作用. 国外近年开始应用反义技术于肿瘤耐药逆转的研究，近来才开始考虑采用 RNAi 的方法. 本研究就是针对肝癌细胞 MDR1基因设计相应的特异序列，连接到带有人 U6 启动子的质粒 DNA 载体上（PGE1 载体） ，采用脂质体转染方法，将其导入细胞内，在 U6 启动子的作用下转录产生 shRNA，从而特异地抑制 MDR1 基因及 Pgp 的过度表达，使其保持在静寂状态来逆转肿瘤 MDR 细胞对多种化疗药物的
23、耐受性，恢复对化疗药物的敏感性，达到提高肿瘤化疗效果的目的. 克服化学合成 RNA 成本高的缺点，采用脂质体转染方法，可克服合成 siRNA 可能造成的 RNase 的污染，更利于 RNAi 技术的推广应用7. 如果对克隆重组子结合抗性筛选后，克服瞬时因转染效率不同所带来的基因表达差异，实现了高效抑制，而且能维持较长时间的基因沉默8. 研究结果表明，pshMDR11 和 pshMDR12 转染 SMMC7721/R细胞后，其细胞 Pgp 表达水平均有明显下降，与 SMMC7721/R 相比较，具有显著性差异（P0.05） ；比较 pshMDR11 和 pshMDR12 转染组之间细胞 Pgp
24、表达，存在显著性差异（P0.05）. 表明重组构建 pshMDR1 质粒转染细胞后，在细胞内可以逆转 MDR1 基因过度表达，同样设计的两段序列在细胞内产生对 MDR1 基因的抑制效果具有显著性差异，可以证明 shRNA 在肝癌耐药细胞内能诱导 RNAi，抑制效果与所选目的基因的靶位点高度相关，其机制还有待进一步探讨. Rhl23 在 Pgp 的功能检测中有重要的价值9. Rhl23 是 Pgp较特异的作用底物，可被 Pgp 泵出细胞外使细胞内 Rh123 浓度降低，表达 MDR1 的细胞内 Rh123 潴留相对较少，通过检测细胞内 Rh123 浓度能直观地反映其功能. 研究表明，pshMDR
25、1 质粒转染细胞后，细胞内Rh123 的荧光表达明显升高，分别与未转染组细胞（SMMC7721/R ）比较，具有显著性差异（P0.05） ，说明转染 pshMDR1 后 Pgp 外排 Rh123功能减弱. 进一步表明所构建的 pshMDR1 真核表达质粒可以抑制 MDR1基因过度表达 Pgp ，使得 Pgp 表达减少. 实验证明：RNA 干扰能够特异地抑制 MDR1 基因的表达，降低耐药细胞表面胯膜蛋白 Pgp 的表达，从而达到逆转肝癌耐药细胞 MDR1，恢复细胞对化疗药物的敏感性，以达到提高肿瘤化疗效果的目的. 研究以特异性 shRNA 介导的 RNAi 系统，为逆转 MDR1 介导肝癌耐药细胞 MDR 的临床应用提供了实验基础，也为增强肝癌的化疗效果、改善预后带来了希望.
