1、TGF- 信号通路及细胞黏附分子在非小细胞肺癌的研究作者：陈卫花，程慧敏，孔庆兖，李龙飞，贾晓民 【摘要】 目的 观察 TGF-1 、TR、Smad2、E-cad、E-sel、integrin-1、ICAM-1 及 CD44v6在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达特征，探讨其与非小细胞肺癌的组织学类型、TNM 分期及淋巴结转移的关系。方法 采用免疫组织化学 SP和 SABC法检测 TGF-1、TR、Smad2、E-cad、 E-sel、integrin-1、ICAM-1 及 CD44v6的表达，并对其与 NSCLC临床病理因素的关系进行分析。结果 TGF-1 与 integrin-1 在肺腺癌
2、组织的阳性表达率显著高于肺鳞状细胞癌组织(P0.05)， E-cad在肺腺癌组织的阳性表达率显著低于肺鳞状细胞癌组织(P0.05)。TGF-1 及 TR在 NSCLC TNM分期期组织的阳性表达率显著低于期和期组织 (P0.01)。TGF-1、TR、Smad2 及 CD44v6在有淋巴结转移的 NSCLC组织中阳性表达率显著高于无淋巴结转移的 NSCLC组织（P0.05）, E-cad在有淋巴结转移的 NSCLC组织中阳性表达率显著低于无淋巴结转移的 NSCLC组织（P0.05） 。结论 TGF-1、E-cad 及 integrin-1 与 NSCLC的组织学类型有关，TGF-1 及 TR能促
3、进 NSCLC的病程进展；TGF-1、TR、Smad2、 E-cad、及 CD44v6的阳性表达与 NSCLC的淋巴结转移密切相关，TGF-1、TR、Smad2、E-cad 及 CD44v6在 NSCLC的淋巴结转移中起着重要的促进作用，可作为估计 NSCLC可能有淋巴结转移的指标。 【关键词】 非小细胞肺癌； TGF- 信号通路；细胞黏附分子；免疫组织化学；淋巴结转移;组织学类型 Abstract: Objective To investigate the relationship between the expression of TGF-1,TR,Smad2, E-cad, E-sel,
4、 integrin-1, ICAM-1 and CD44v6, and the tissue type, TNM stages and lymph node metastasis in human NSCLC. Methods Immunohistochemical methods (SP and SABC) were used to examine the expressions of the eight indexes mentioned above and the results were processed statistically to reveal their correlati
5、ons with the clinicopathological characters of NSCLC. Results The expressions of TGF-1 and integrin-1 were higher in adenocarcinoma than those in squamous carcinoma of lung (P0.05); the expression of E-cad was lower in adenocarcinoma than in squamous carcinoma (P0.05); the expressions of TGF-1 and T
6、Rwere higher in TNM stagesthan those in TNM stagesand of NSCLC (P0.01). However, the lymph node metastasis was positively correlated with the expressions of TGF-1, TR, Smad2 and CD44v6, but negatively with the expression of E-cad in NSCLC (P0.05). Conclusion TGF-1, E-cad and integrin-1 are distinctl
7、y correlated with the tissue type of NSCLC; TGF-1 and TR accelerate the progress of NSCLC. The expressions of TGF-1, TR, Smad2, E-cad and CD44v6 are correlated with lymph node involvements in NSCLC, promoting lymph node metastasis, and can be taken as the indexes indicating the possibility of lymph
8、node metastasis. Key words: non-small cell lung carcinoma; transforming growth factor beta signaling; cellular adhesion molecules; immunohistochemistry; lymph node metastasis; tissue type TGF-(transforming growth factor -)家族和细胞黏附分子（cellular adhesion molecules，CAMs）是近年倍受关注的与非小细胞肺癌淋巴结转移有关的因素。TGF- 家族是为
9、数不多的内源性细胞生长调节蛋白,它们是调节细胞增殖、分化、迁移、免疫反应、血管生成及凋亡的多肽生长因子。许多研究发现,TGF-1 信号通路能够促进肿瘤发生、浸润和转移的进程1-2 。 细胞黏附分子包括选择素家族、免疫球蛋白超家族、整合素家族、钙粘素家族以及一些未归类的家族如 CD44家族，它是细胞膜上的一类跨膜糖蛋白, 能够介导肿瘤细胞与细胞外基质、血管内皮细胞及实质器官组织细胞或与其他肿瘤细胞之间的相互作用, 与肿瘤的侵袭转移关系密切3 。 本实验采用免疫组织化学技术检测了 TGF-1、TR、Smad2、E-cad、E-sel、integrin-1、ICAM-1 及 CD44v6在非小细胞肺
10、癌（NSCLC）中的表达,进一步探讨其与非小细胞肺癌的组织学类型、TNM 分期及淋巴结转移的关系，以期为临床判定非小细胞肺癌患者的淋巴结转移提供客观依据。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 临床材料 徐州医学院第二附属医院病理科自 1995年至 2004年 10年间存档的原发性非小细胞肺癌手术后的石蜡组织标本 56例,其中男 37例,女 19例,年龄 3681 岁。肺癌组织学分类依据 WHO标准分类,其中腺癌 36例,鳞状细胞癌 20例。TNM 分期: 期 36例, 期 8例, 期 12例，期 0例。其中手术切除后病理检查证实有肺门或纵隔淋巴结转移的 25例，未转移者 31例。所有病例
11、术前均未经放射或化学治疗。 1.1.2 主要试剂 鼠抗人 TGF-1、TR、Smad2、 E-cad及CD44v6单克隆抗体，SP 试剂盒（即用型） ，DAB 二氨基联苯显色剂试剂盒，PBS液等，购自福州迈新生物技术开发有限公司。兔抗人浓缩液intergrin-1、ICAM-1 及 E-sel单克隆抗体（工作浓度 1100） ，SABC试剂盒（即用型） ，DAB 二氨基联苯显色剂试剂盒，PBS 液等，购自武汉博士德生物工程有限公司。 1.2 方法 1.2.1 标本处理 全部组织均经 10 %甲醛液固定后取材,进行常规脱水、透明、浸蜡、包埋，每个组织蜡块 4 m 厚连续切片 9张。1 张用于常规
12、苏木精- 伊红染色，其余 8张用于免疫组织化学染色。 1.2.2 免疫组织化学染色 SABC法及 SP法。每组染色，设立已知的阳性对照片为阳性对照、PBS 液代替一抗作为阴性对照。 1.2.3 染色结果判定标准 定性:至少观察 5个 400倍的视野，5%的肿瘤细胞的细胞膜或（和）细胞质染成棕黄色为阳性，否则为阴性。 定位 : TGF-1、E-sel、integrin-1 及 ICAM-1的表达定位在细胞质，TR、Smad2、E-cad 及 CD44v6的表达定位在细胞膜和细胞质。 1.3 统计学处理 统计数据采用四格表 2 检验或确切概率法，应用Stata软件进行数据处理,检验水准:=0.05
13、 。 2 结 果 2.1 TGF-1、TR、Smad2、E-cad、E-sel、integrin-1、ICAM-1 及 CD44v6在 NSCLC中的表达 TGF-1、E-sel、integrin-1 及 ICAM-1表达于肿瘤细胞的细胞质（图 1、2、3、4） 。TR、Smad2、E-cad 及 CD44v6表达于肿瘤细胞的细胞膜和细胞质（图5、6、7、8） 。 2.2 TGF-1、TR 、Smad2、 E-cad、E-sel、 integrin-1、 ICAM-1及 CD44v6在肺腺癌及肺鳞状细胞癌中的表达 由表 1可见,TGF-1 及 integrin-1 在肺腺癌组织中的表达阳性率分
14、别为 57%(20/35) 、83%(29/35),显著高于其在肺鳞状细胞癌组织中的表达阳性率 24%(5/21)、52%(11/21)，有显著性差异（P0.05） ；而 E-cad在肺腺癌组织中的表达阳性率 6%(2/35)显著低于其在肺鳞状细胞癌组织中的表达阳性率29%(6/21),有显著性差异（P0.05）;TR 、Smad2、E-sel、 ICAM-1及 CD44v6在肺腺癌组织中的表达阳性率与肺鳞状细胞癌组织中的表达阳性率无显著差别（P0.05） 。表 1 各指标在肺腺癌及肺鳞状细胞癌中的表达 2.3 TGF-1、TR、Smad2、 E-cad、E-sel、 integrin-1、
15、ICAM-1及 CD44v6在不同 TNM分期中的表达 由表 2可知,TGF-1、TR在 NSCLC TNM分期期组织中的表达阳性率为 25%(9/36) 、28%(10/36),显著低于、期组织中的表达阳性率 80%(16/20) 、85%(17/20),差异显著（P0.01） 。Smad2、 E-cad、E-sel、 integrin-1、 ICAM-1及 CD44v6在 NSCLC TNM分期期组织中的表达阳性率与、期组织中的表达阳性率无显著差别（P0.05） 。 2.4 TGF-1、TR、Smad2、 E-cad、E-sel、 integrin-1、 ICAM-1及 CD44v6的表达
16、与 NSCLC淋巴结转移的关系 表 3显示,TGF-1、TR、Smad2 及 CD44v6在有淋巴结转移的 NSCLC组织中表达阳性率为 72%（18/25） 、80%（20/25） 、64%（16/25）及 80%（20/25） ，显著高于无淋巴结转移的 NSCLC组织中表达阳性率 24%（7/31） 、24%（7/31） 、36%（11/31）及 29%（9/31）,统计学显示有显著性差异（P0.05） ；而 E-cad在有淋巴结转移的 NSCLC组织中表达阳性率为16%（4/25） ，显著低于无淋巴结转移的 NSCLC组织中表达阳性率65%（20/31） ，有显著性差异（P0.05） 。
17、E-sel、integrin-1 及ICAM-1在有淋巴结转移的 NSCLC组织中表达阳性率与无淋巴结转移的NSCLC组织中表达阳性率无显著差别（P0.05） 。表 2 各指标在不同TNM分期中的表达表 3 各指标表达与 NSCLC7淋巴结转移的关系 3 讨 论 近来研究表明，TGF- 家族和细胞黏附分子在非小细胞肺癌进展及淋巴结转移中起着重要的作用。本实验重点检测 TGF-1、TR、Smad2、 E-cad、E-sel、 integrin-1 、 ICAM-1及 CD44v6在非小细胞肺癌中的表达，观察它们与非小细胞肺癌的组织学类型、TNM 分期及淋巴结转移的关系。 TGF- 是一类相对分子
18、质量为 25103的二聚体多肽生长因子,它共有 5 种同分异构体(TGF-1、TGF-2、TGF-3、TGF-4、TGF-5)，哺乳类动物中有 3 种(TGF-1 、TGF-2、TGF-3) ，其中以 TGF-1 最具有代表性。TGF- 是以无活性的 TGF- 前体分子形式分泌的，只有活化后的 TGF- 和受体结合才能发挥其生物活性。TGF- 受体( TR) 有 3 种，即 TR、TR、TR,但只有、型是 TGF- 信号通路必须的。TR、TR都是跨膜糖蛋白，有胞外区(近膜侧有保守的“Cys 盒”) 、跨膜区和胞质内区(具有丝/苏氨酸激酶活性)。其中TR胞内羧基端有一个富含丝/ 苏氨酸残基的短尾
19、而无 GS（Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly 序列）区,可以在无配体结合的条件下发生自体磷酸化,并能与游离的 TGF-s 结合，激活 TGF-型受体，使 TGF-型受体磷酸化，激活 Smads。Smads 是介导 TGF- 超家族受体到核基因的信号传递蛋白家族。目前发现哺乳动物 Smads 有 8 种(Smad1Smad8)，典型的Smads 蛋白由三部分组成,氨基端和羧基端高度保守的 MH1和 MH2 结构域,其间有富含脯氨酸的间隔区(Linker)也即居中连接区。MH1 区是 DNA结合区；MH2区是效应区，参与 Smad与受体的结合，并具有转录激活功能。根据结构和功能的不同
20、 Smads分为三类:第一类是 R-Smads,包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5, Smad8;第二类是 Co-Smads，包括Smad4/DPC4( deleted in pancreatic carcinoma 4);第三类为 anti-Smads,包括 Smad6、Smad7。其中 Smad2Smad4、Smad7 参与 TGF-s 的信号转导，使 TGF- 信号与基因表达偶联。 本研究结果显示:TGF-1 在肺腺癌组织中的表达阳性率显著高于肺鳞状细胞癌组织中的表达阳性率，提示 TGF-1 在不同组织学类型中的表达是不同的。此结果与 Hasegawa等4研究表明 TGF
21、-1 的表达与肺腺癌显著相关的结果一致,但具体机制尚不清楚，有待于进一步的研究。TR与 Smad2在肺腺癌组织中的表达阳性率与肺鳞状细胞癌组织中的表达阳性率无显著差异，提示 TR及 Smad2的表达与 NSCLC的组织类型无密切关系。TGF-1 及 TR在 NSCLC的 TNM分期期组织中的表达阳性率显著低于、期组织中的表达阳性率，提示 TGF-1及 TR促进 NSCLC的进展。此结果与 Kim等5研究表明 TGF-1在 NSCLC TNM分期期组织中的表达明显升高（P=0.03） 、Kang 等6认为 TGF- 信号转导途径有助于肺癌的进展及 Ueki等7研究表明TGF-1 在肺癌的表达与肺
22、癌进展呈正相关的结果相一致，这可能与在细胞恶变时，TGF- 信号转导途径中的成员发生改变，导致肿瘤细胞对TGF- 的生长抑制产生耐受，使肿瘤细胞生长失去控制有关；而与Zhang等8研究发现 TR的表达在阻止肺癌的进展中具有决定性意义的结果不一致，且 Smad2在 NSCLC的 TNM分期期组织中的表达阳性率与、期组织中的表达阳性率无显著差异。提示 TGF-1、TR及 Smad2在 NSCLC的进展中所起确切作用有待于进一步的研究。TGF-1、TR及 Smad2在有淋巴结转移的 NSCLC中表达阳性率显著高于无淋巴结转移的 NSCLC。提示 TGF-1、TR及 Smad2的阳性表达与NSCLC的
23、淋巴结转移密切相关,在 NSCLC的淋巴结转移过程中起着重要的促进作用。此结果与 Hasegawa等4研究中有淋巴结转移的 NSCLC患者其 TGF-1 蛋白水平显著高于无淋巴结转移的患者（P=0.02）结果相一致。这可能与:TGF- 能够通过诱导肿瘤细胞周围其他细胞旁分泌血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）促进血管生成刺激晚期肿瘤生长及增加肿瘤的侵袭和转移能力；TGF- 可以减少某些 ECM降解酶的生成（包括胶原酶、基质纤维酶）增加某些抑制降解酶的蛋白产生（如纤溶酶原活化抑制因子） ，肿瘤细胞中 TGF- 生成增加，使蛋白水解酶活
24、性增强，导致肿瘤细胞的侵袭能力增强；TGF- 能抑制 Th1型细胞免疫，增强 Th2型细胞免疫,而 Th1型细胞免疫在抗肿瘤的细胞免疫中起着积极的作用，Th2 型细胞免疫对肿瘤免疫起着负面作用，使肿瘤能动性抑制机体免疫,实现免疫逃逸，增加肿瘤的侵袭和转移的概率有关。 细胞黏附分子包括选择素家族、免疫球蛋白超家族、整合素家族、钙粘素家族以及一些未归类的家族如 CD44家族。 钙黏蛋白(Cadherin) 912是一类钙离子依赖的黏附分子家族。在人类至少有 10 多种钙黏附蛋白,其中与肿瘤免疫关系密切的有 E-cad、N-cad 和 P-cad三类, E、N 和 P 分别表示上皮、神经和胎盘来源。
25、Kadowaki等13证明，食管癌中 E-cad减少与肿瘤的淋巴结转移有关。本研究结果中:E-cad 在肺腺癌组织中的表达阳性率显著低于肺鳞状细胞癌组织中的表达阳性率，提示 E-cad表达下调或缺失与 NSCLC的组织学类型有密切关系，但是具体机制尚不清楚，有待于进一步研究。E-cad 在有淋巴结转移的 NSCLC中表达的阳性率显著低于无淋巴结转移的 NSCLC。提示 E-cad的阳性表达与 NSCLC的淋巴结转移密切相关,E-cad在 NSCLC的淋巴结转移过程中起着重要的促进作用。这可能与钙黏附蛋白分子在分子与分子连接方面具有特异性,并参与选择性细胞黏附，它的失活引起细胞-细胞连接的破坏使
26、肿瘤细胞丧失黏附能力而发生转移有关。本实验未发现 E-cad在 NSCLC的 TNM分期中的显著作用，这可能与我们的实验标本量较少有关。 选择素(selectin) 9，14包括 L-sel(CD62L )、P-sel(CD62P )、E-sel(CD62E) 三个成员。Stone 等15研究发现 P-sel可介导肿瘤细胞与激活的血小板黏附，促进肿瘤转移。周同等16研究发现黏附分子 P-sel与肾癌的病情发展有关。E-sel 是存在于血管内皮细胞表面的一种黏附分子。本实验未发现 E-sel的表达与 NSCLC的组织学分类、TNM 分期及淋巴结转移有关。 整合素(integrin)12,17是一组二价离子依赖性细胞表面糖蛋白, 介导细胞间及细胞与细胞外基质的黏附反应, 每种整合素都是由 、亚基以非共价健结合而成的异二聚体。已发现 7种 亚基单位, 11 种 亚单位, 可形成至少 20 种整合素。Albelda 等18等研究结果显示，6 表达下降及 4 表达增强与肿瘤转移关系密切。本研究结果显示，integrin-1 在肺腺癌组织中的表达阳性率显著高于肺鳞状细胞癌组织中的表达阳性率，提示 integrin-1 在不同组织学类型中的表达是不同
