1、siRNAID1 对人肝癌细胞 HepG2 中 ERK信号通路的影响【摘要】 目的 观察 siRNAID1 转染人肝癌细胞 HepG2 细胞后对肝癌细胞系 HepG2 细胞增殖的影响及其对 ERK1/2 通路的作用。 方法 实验分为 4 组，即空白对照组、转染试剂组、转染对照组及转染siRNAID1 组。阳离子脂质体法介导 siID1 转染肝癌细胞后，唑蓝比色法(MTT)观察 HepG2 细胞增殖情况。分别用反转录聚合酶链式反应法(RTPCR) 和蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测转染后pERK1/2 、ERK1/2 mRNA 与蛋白表达的情况。 结果 转染 siRNAID
2、1的 HepG2 细胞增殖速度明显减慢(P0.01)。转染后 ERK1/2 及pERK1/2 mRNA 表达降低(P0.01);pERK1/2 蛋白的表达较空白对照组明显降低(P0.05)，ERK1/2 蛋白表达空白变化不明显。 结论 siRNAID1 转染 HepG2 细胞后可明显抑制细胞的增殖，使得 ERK1/2 基因表达活性下降，提示 ID1 有可能通过 ERK1/2 信号转导通路介导,促进肝细胞癌 HepG2 细胞的增殖。 【关键词】 抑制因子，免疫; 丝裂原激活蛋白激酶类; 细胞外信号调节 MAP 激酶类; 肝肿瘤; 转染; 信号传导; 氮蓝四唑; RNA，小分子干扰近期发现，丝裂原
3、活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)信号途径的激活可能是 DNA 结合抑制因子1(inhibitor of differentiation/DNA binding1, IDl) 诱导细胞增殖的一个机制1。与正常组织相比较，肝癌组织中的 MAPK 通路上的细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase, ERK)都是处于高表达及高活性状态。若使用其 ERK 抑制剂就可以减缓细胞的增殖及引起细胞的凋亡2。本研究通过小分子干扰 RNA 技术使 ID1 基因沉默，观察其对 HepG2 细胞增殖的影
4、响及其对 ERK1/2 mRNA 及蛋白表达的影响，探讨 ERK1/2 及其信号转导途径与肝癌发生发展的关系。1 材料和方法1.1 材料 人肝癌细胞株 HepG2 细胞(上海科学院细胞中心);siRNA试剂(广州锐博生物有限公司);四甲基偶氮唑蓝(MTT，厦门泰京生物有限公司);逆转录 聚合酶链反应(RTPCR) 试剂盒(美国 Fermentas 公司);PCR 引物由上海鼎安生物科技有限公司合成;兔抗人 ERK1/2 多克隆抗体，兔抗人 pERK1/2 多克隆抗体，辣根过氧化酶 (HRP)标记的羊抗兔IgG(美国 Santa Cruz 公司)。1.2 分组 分为 4 组，即空白对照组(正常培
5、养 HepG2 细胞组);转染试剂组(即仅加入 Lipofectamine 2000 组;转染对照组(即转染非特异性序列 control siRNA 组);转染 siRNAID1 组。1.3 方法1.3.1 siRNA 的设计和合成 siRNAID1 由广州市锐博生物科技有限公司设计合成。靶序列：5TGAGCAAGGTGGAGATTCT3正义链：5UGAGCAAGGUGGAGAUUCU dTdT3反义链：3dTdT ACUCGUUCCACCUCUAAGA51.3.2 细胞的培养与转染 细胞常规培养于含 10%胎牛血清(FBS)的 RPMI 1640 培养基，于 37 、体积分数为 0.05 的
6、 CO2 培养箱中培养。取对数生长期细胞，用含 10%胎牛血清的 RPMI 1640 培养基(无抗生素)将消化后的 HepG2 细胞制备成细胞悬液;调整细胞浓度为 1107 L-1，接种于细胞培养板内(6 孔加入 2 mL，每孔 2104 细胞)，培养 24 h。参照说明书建议，将 siRNA 浓度稀释为 50 nmmol/L，阳离子脂质体法介导siRNAID1 转染肝癌细胞。存放 24 h 后备检测。1.3.3 MTT 法测定细胞增殖 将对数生长期细胞接种于 96 孔板，每组设 4 个复孔，分别于培养 24，48，72，96 h 后;每孔加入 20 L MTT(5 g/L)，继续培养 4 h
7、。弃去上清，每孔加二甲基亚砜(DMSO)150 L，平板摇床震摇 10 min，酶联免疫检测仪测定 490 nm 处的吸光度(OD值)。细胞增殖抑制率=(空白对照组 OD 值-实验组 OD 值)/空白对照组 OD值1.3.4 RTPCR 检测 ERK1/2 及 pERK1/2 mRNA 的表达水平 用Trizol 提取总 RNA，反转录成 cDNA。(1)内对照 肌动蛋白(actin) ，扩增片段 556 bp;循环条件：4 预变性 5 min，扩增 94 30 s57 30 s72 45 s，30 个循环，最终延伸 72 7 min。上游：5AAA GAC CTG TAC GCC AAC A
8、CAG3下游：5TTT TAG GAT GGC AAG GGA CTT C3(2)ERK1/2 扩增片段 320 bp;循环条件：预变性 5 min，扩增 94 30 s59 30 s72 30 s，30 个循环，最终延伸 72 7 min。上游：5TAC ACG CAG TTG CAG TAC ATC G3下游：5CGC AGG ATC TGG TAG AGG AAG T3(3)pERK1/2 扩增片段 248 bp;循环条件：94 预变性 5 min，扩增 94 30 s55 30 s72 30 s，30 个循环，最终延伸 72 7 min。上游：5GGA GCT TGT GGA AAT
9、ACC TTG G3下游：5GAC GCA GTG TTC CTC TCT GCT A3PCR 扩增产物用凝胶图像分析系统进行灰度扫描。1.3.5 Western blot 法检测 ERK1/2 及 pERK1/2 蛋白的表达水平 细胞总蛋白的提取，采用 BioRad DC Protein Assay 试剂盒测定蛋白浓度，进行 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳条件：110 V，约 2 h。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜，利用预染蛋白标准判断，让目的条带跑过分离胶的 1/3。电泳结束后，电转移法将蛋白从凝胶中转移到硝酸纤维膜上，将硝酸纤维素膜置于含 5%脱脂奶粉的 TBST 中，室温封
10、闭 1 h。将膜 ERK1/2 抗体(1800)或 pERK1/2 抗体(11 000)4 孵育过夜。将膜与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG(16 000)室温摇晃 1 h，硝酸纤维膜用化学发光试剂盒处理并在暗室显影、定影，最后进行凝胶图像分析。1.4 统计学处理 数据以 xs 表示，采用 SPSS 13.0 统计软件进行分析处理，组间比较用方差分析(OneWay ANOVA)及 LSD 检验，以P0.05 表示差别有统计学意义。2 结 果2.1 siRNAID1 转染后 HepG2 细胞的增殖活性变化 转染siRNAID1 对 HepG2 细胞增殖有明显抑制作用，增殖抑制率明显高于转染对
11、照组、转染试剂组(P0.01);且转染对照组与转染试剂组间的差别无统计学意义(P0.05，表 1)。表 1 HepG2 4 组细胞转染后细胞吸光度值2.2 半定量 RTPCR 检测结果 HepG2 细胞中 ERK1/2 及 pERK1/2 mRNA 在正常培养条件下均存在表达;与转染对照组、转染试剂组及空白对照组相比，转染 siRNAID1 后 ERK1/2 及 pERK1/2 mRNA 水平均被有效抑制。2.3 RNA 干扰后 ERK1/2 及 pERK1/2 蛋白表达 转染siRNAID1 后，转染 siRNAID1 组的细胞 pERK1/2 蛋白表达明显低于转染对照组、转染试剂组及空白对
12、照组。ImageProPlus 图像分析显示，siRNAID1 组细胞 pERK1/2 蛋白的表达较其余 3 组降低，差别具有统计学意义(P0.05)，而 ERK1/2 蛋白的表达变化不明显。3 讨 论MAPK 系统是细胞内的一簇丝/苏氨酸蛋白激表 2 siRNA 转染 24 h后 ERK1/2 与 pERK1/2 mRNA 表达情况Tab 2 The results of ERK1/2 and pERK1/2 mRNA after transfection 24 hours 分 组 ERK1/2/actinpERK1/2/actin空白对照组 0.630.110.780.12 转染试剂组 0
13、.700.100.830.13转染对照组 0.680.050.750.11 转染 siRNAID1 组 0.180.020.250.03 n=4. 与空白对照组比较，：P0.01.酶，ERK 包括 ERK1 和 ERK2，是 MAPK 家族的重要成员34 。ERK1/2 是由 Boulton 等于 1990 年代初期先后分离鉴定的一种蛋白激酶，相对分子质量分别为 44 kD 和 42 kD，具有 90%的同源性。ERK1/2 为脯氨酸导向的丝氨酸/苏氨酸激酶，可以 A：EKR1/2;B:pERK1/2. 1.空白对照组;2.转染试剂组;3.转染对照组;4.转染 siRNAID1 组.图 1 R
14、TPCR 法检测 RNA 干扰 24 h 后 HepG2 细胞 ERK1/2 与pERK1/2 mRNA 的表达Fig 1 Effects of siRNA on ERK1/2 and pERK1/2 mRNA expression in HepG2 cells by RTPCRn=4. A：RNA 干扰 24 h 后 HepG2 细胞 ERK 与 pERK1/2 蛋白电泳图. 1：空白对照组;2：转染试剂组;3：转染对照组;4：转染siRNAID1 组. B：RNA 干扰 24 h 后 HepG2 细胞 ERK 与 pERK1/2 蛋白含量表达. 与空白对照组比较，：P0.05.使脯氨酸相邻
15、的丝氨酸/苏氨酸磷酸化。ERK1/2 的活化是将信号从细胞膜表面受体转导至核的关键。其活化的中心是使 Ras 进行鸟苷酸交换变成其活化形式 RasGTP 。ERK1/2 是 Ras 通路中重要的信号分子，位于 Ras 的下游，主要由生长因子受体(或蛋白质酪氨酸激酶受体)介导激活，并需要 Ras，PKC 和 Raf 蛋白参与。平时 ERK 位于细胞质内，一旦被激活，即发生磷酸化，磷酸化的 ERK 迅速穿过核膜，再激活转录因子或/和 P70 核蛋白体 S6 激酶。PD98059 是 ERK1/2 信号转导途径的抑制剂，它可以结合 ERKI/2 并使其失活，阻止 Raf 对 ERK1/2 的磷酸化和
16、激活56 。由于 ERK 通过磷酸化反应可调节某些转录因子的活性，如Eikl ，cMyc ，STATs，Jun，Fos，ATF2 和 Max 等，这些转录因子进一步调节它们各自靶基因的转录，引起特定蛋白的表达或活性改变，最终调节细胞代谢和功能，影响细胞产生特定的生物学效应，例如调控细胞增殖、凋亡与侵袭等，是各种各样细胞外刺激信号引起细胞增殖分化的细胞内信息传递的共同通路或交汇点78 。研究表明，异位表达ID1 的前列腺癌细胞 LNCaP 中，MAPK 途径的几个关键性调节因子，如RAF 和 MEK1/2 磷酸化形式的增加，可能导致 IDl 的表达9。另一研究也发现 ID1 可能通过激活 MAP
17、K 途径诱导肿瘤细胞增殖10。Kim 等研究显示，通过激活 ERK1/2 信号通路，可提高 ID1 诱导人脐带内皮细胞和乳腺癌细胞株 MCF7 低氧诱导分子1a 的稳定性和活性，进而诱导微血管的形成及 VEGF 表达，参与调节肿瘤血管发生，他们都认为ID1 、ERK1/2 对人类多种肿瘤细胞的发生和进展有着及其重要的作用11。大量研究表明，ID1 在促进肝癌细胞 HepG2 增殖和抑制细胞凋亡的发挥重要作用，是肿瘤发生、发展过程中的正调节蛋白。而 RNAi 技术以其高效、稳定、高特异性等特点，已成为肿瘤基因治疗的新的研究热点。前期笔者做过实验，证实 siRNAID1 转染入肝癌 HepG2 细
18、胞后ID1 基因的表达以及肝癌细胞的增殖受到明显的抑制。此次试验结果表明，siRNAID1 转染入肝癌细胞 HepG2 后细胞的增殖明显受抑制，转染实验组和转染对照组、转染试剂组及空白对照组之间的比较具有统计学意义(P0.01)，这和转染 siRNA 后细胞周期进程的抑制是相符合的。另外，24 h 后 RTPCR 检测 ERK1/2 及 pERK1/2 mRNA 表达降低(P0.01)，而转染对照组、转染试剂组及空白对照组的 ERKl/2 及pERK1/2 mRNA 比较差别无明显意义，该结果表明，siRNAID1 可有效沉默 ERKl/2 及具有活性的 pERKl/2 mRNA 表达。Wes
19、tern blotting检测进一步证实，转染实验组 pERK1/2 蛋白的表达较转染对照组、转染试剂组及空白对照组明显降低(P0.05)，而 ERK1/2 蛋白表达变化不明显，这说明了非活性状态的 ERK1/2 蛋白表达不受或受影响不明显，而活性状态的 ERK1/2 表达则明显降低，由此推测，只有 pERK1/2 表达降低，才能抑制某些转录因子的活性，进而使得特定蛋白的表达降低，最终影响细胞增殖、代谢和功能。说明应用 RNA 干扰靶向抑制 ID1 基因可进一步的阻滞 ERK1/2 通路的激活。因此，有理由推测 ID1 和ERK1/2 基因在促进肿瘤细胞增殖中有着协同效应，以及 ID1 在肝癌
20、细胞中的表达和 ERK1/2 信号通路的活性有一定的相关性，ERK1/2 信号通路有可能参与 ID1 促进肿瘤细胞的增殖。【参考文献】1 Lee K H,Choi E Y,Hyun M S, et al. Cellular mechanisms of hepatocyte growth factormediated urokinase plasminogen activator secretion by MAPK signaling in hepatocellular carcinomaJ. Tumori, 2008,94(4):523530.2 Cusimano A,Foder D,DAle
21、ssandro N, et al. Potentiation of the antitumor effects of both selective cyclooxygenase1 and cyclooxygenase2 inhibitors in humanhepatic cancer cells by inhibition of the MEK/ERK pathwayJ. Cancer Biol Ther, 2007,6(9):14611468.3 Hagemann C,Blank J L. The ups and downs of MEK kinase interactionsJ. Cel
22、l Signal, 2001,13(12):863875.4 Chang L,Karin M. Mammalian Jan MAP kinase signaling cascadesJ. Nature, 2001,410(6824):3740.5 Boulton T G,Nye S H,Robbins D J, et al. ERKs: a family of porteinserine/threonine kinases thatrae activated and tyrosinephosphoyraltde in response to insulin and NGFJ.Cell, 199
23、1,65(4):663675.6 Boulton T G,Yancopoulos G D,Gregory J S, et al. An insulinstimualted protein kinase similar to yeast kinases involved in cell cycle controlJ. Sceinces, 1990,249(4964):4667.7 Rice P L,Goldberg R J,Ray E C, et al. Inhibition of extracellular signalregulated kinase 1/2 phosphorylation
24、and induction of apotosis by sulindac metabolitesJ. Cancer Res, 2001,61(4):15411547.8 Ajenjo N,Aaronson D S,Ceballos E, et al. Myeloid leukemia cell growth and differentiation are independent of mitogenactivated protein kinase ERK1/2 activationJ. J Biol Chem, 2000,275(10):71897197.9 Lee K T,Lee Y W,
25、Lee J K. Overexpression of ID1 is significantly associated with tumor angiogenesis in human pancreas cancersJ. Br J Cancer, 2004,90(6):11981203.10 Ling M T，Wang X，Ouyang X S，et al.Activation of MAPK signaling pathway is essential for Id1 induced serum independent prostate cancer cell growthJ.Oncogene，2002，21(55)：84988505.11 Kim H J,Chung H,Yoo Y G, et al. Inhibitor of DNA binding 1 activates vascular endothelial growth factor through enhancing the stability and activity of hypoxiainducible factor1 alphaJ. Mol Cancer Res, 2007,5(4):321329.
