1、VES 诱导口腔鳞癌 Tca8113 细胞凋亡的实验研究【关键词】 VES；,口腔鳞癌；,bax 基因 【摘要】 目的 明确 VES对口腔鳞癌细胞 Tca8113的作用，为临床应用 VES防治口腔鳞癌提供科学的实验数据。方法 RTPCR法检测促凋亡基因 bax在 mRNA水平上的表达，Western blot检测促凋亡基因 bax在蛋白水平上的表达。结果 bax基因在 mRNA水平上及蛋白水平上表达上调。结论 VES诱导口腔鳞癌细胞 Tca8113的凋亡作用，bax 基因可能参与该过程。 【关键词】 VES；口腔鳞癌；bax 基因 【Abstract】 Objective To probe i
2、nto vitamin E succinate for selective antitumour activity in oral squamous cell carcinomas. Methods Using RTPCR detected and quantified the expression of bax mRNA. Western blot measured relative amounts of the bax protein.Results Bax mRNA and protein levels upregulated.Conclusion The mechanism of ap
3、optosis is possibly related to the expression of bax. 【Key words】 VES,oral squamous cell carcinomas,bax gene 维生素 E琥珀酸酯（vitamin E succinate, VES）因其含有 OCO(CH2)2COO基团,在生理酸碱条件下可以带电荷，这个基团在高选择性地诱导肿瘤细胞凋亡的过程中扮演了重要角色1 ，根据众多文献报道24 ，VES对前列腺癌、乳腺癌、消化道系统的恶性肿瘤特别是对头颈部肿瘤有明显的抑制作用，其主要作用机制是诱导肿瘤细胞或者刚刚变异的细胞凋亡。本文采用体外培养的口腔
4、鳞癌细胞 Tca8113株检测了 bax基因在VES诱导的口腔鳞癌细胞凋亡中的表达。 1 材料和方法 11 材料 VES购自 Sigma 公司，Tca8113 细胞株购自中科院上海细胞所，RPMI 1640培养基购自 Gibco公司，bax 基因引物：5TGGCGATGAACTGGACAACAAC3,5CCCGAAGTAGGAAAGGAGGC3；actin 基因引物 5AACCGTGAAAAGATGACCCAG3, 5CTCCTGCTTGCTGATCCACAT3。 12 方法 121 细胞培养 Tca8113 细胞接种于细胞培养瓶中，加入含 10%小牛血清，100 U/ml 青霉素、链霉素的
5、RPMI 1640培养液，培养于 37 、5%CO2培养箱中，每 34 d传代 1次。 122 反转录聚合酶链式反应（RTPCR) ：选取实验组、对照组细胞，加入 1 ml RNA exReagent，将细胞并 RNA exReagent一起移入 Ep管中。室温静置 5 min，再加入 200 l 氯仿，用力颠倒 Ep管混匀。静置 5 min后，12 000 r/min 10 min。小心将上层水相移至 Ep管中，加入 500 l 异丙醇，振荡混匀，室温静置 8 min。高速离心 5 min，小心弃上清。加入 1 ml 75%乙醇，振荡片刻，7 500 r/min 5 min，小心弃上清。室温
6、静置 12 min使 RNA沉淀恰好干燥，加入水溶解 RNA。720 分光光度计上测 260 nm、280 nm的 OD值，计算 RNA的浓度。取等量RNA、OligdT、DEPC 水共 13 l。70 加热 8 min，立即将微量离心管冰浴至少 1 min，然后加入下列试剂：5buffer 5 l，dNTPs 5 l，MMLVRT 1 l，Rasin 1 l，轻轻混匀，放入 37 恒温水浴锅中60 min。90 ，23 min。50 l 反应体系：灭菌三蒸水 34 l，引物1 1 l，引物 2 1 l，10buffer (MgCl2 2.5mmol/L) 5 l，dNTPs 5 l，Taq
7、酶 1 l，cDNA 3 l，混匀，7 500 r/min 30 s，石蜡油覆盖。PCR 循环参数设置：预变性 94 350 s，变性 94 60 s，退火 60 60 s，延伸 72 60 s，再延伸 72 300 s，共 35个循环。 123 Western Blot定量蛋白：收集实验组、对照组细胞裂解，SDS聚丙烯酰胺凝胶加样，当溴酚蓝到达胶底部时停止，把胶放入缓冲液中平衡 10 min。转膜后放入 5%脱脂奶粉、003%叠氮钠的 TBS中平衡 1 h。加一抗，摇床上作用 8 h。TBST 漂洗 3次，每次 5 min。加二抗，摇床上作用 2 h。ECL 荧光显影液加膜上 1 min，终
8、止反应，暗室内显影，定影。 2 结果 21 RTPCR结果 bax 基因经 PCR扩增后，15%的琼脂糖凝胶上电泳，在 Eagle Eye 凝胶成像分析仪上可以看到图 1的条带，为使实验有一定的可比性，设置内参 actin，其中对照组亮度明显低于 VES作用6、12、24 h 的亮度。bax 基因与 actin基因条带的灰度比值见表 1。 图 1 bax基因在 mRNA水平上的表达随时间的变化图（略） 表 1 bax基因和 actin基因条带的灰度比值（略） 与对照组相比 P005 22 Western blot 结果 随着 VES作用于 Tca8113细胞时间的延长，bax条带越来越亮。ba
9、x 蛋白和 actin蛋白条带的灰度比值见表 2。 表 2 bax蛋白和 actin蛋白条带的灰度比值（略） 与对照组相比 P005 3 讨论 1998 年美国研究人员 Hartman等对维生素 E和 胡萝卜素预防肿瘤的研究表明 ，服用维生素 E的受试者中，肿瘤的发病率降低 32%，死亡率降低 41%，由此维生素 E防治肿瘤受到极大的关注。2000 年以美国国立肿瘤研究所做了大规模的临床实验6 ，大约有 32 000美国男性参与此实验，受试者每日服用 200 g 硒和 400国际单位的合成维生素E，研究发现维生素 E不仅能降低肿瘤的发病率和死亡率，而且对体外培养的肿瘤细胞有较高的细胞毒性。VE
10、S 是维生素 E的酯化衍生物，与维生素 E及其衍生物相比，VES 的功能有严格的选择性，它能诱导变异细胞和癌细胞凋亡，并能促进正常细胞分化79 。然而 VES对口腔鳞癌的抑制作用尚未见报道。结果显示 VES能抑制口腔鳞癌细胞生长并诱导细胞凋亡，VES 作用于口腔鳞癌细胞 3 h后细胞活率显著降低；随着 VES作用时间的延长，LDH 释放增加，反映了鳞癌细胞膜的受损越来越严重。从流式细胞仪检测结果看到 VES引起细胞死亡的方式主要是凋亡，VES 作用24 h后凋亡的鳞癌细胞达到最大峰值（结果正在进一步整理中） 。本文RTPCR反应是以鳞癌细胞总 RNA为模板，依据 bax的 cDNA设计引物，对
11、其进行 mRNA水平上的半定量，并利用 Western实验在蛋白水平上也进行了定量，结果显示促凋亡基因 bax无论在 mRNA水平还是在蛋白水平其表达量在 VES作用的 24 h内持续增加，提示其持续增加可能导致了鳞癌细胞的凋亡。当然细胞凋亡的发生不仅取决于 bax基因，还受到其他基因如 bcl2家族的影响，因此 VES诱导鳞癌细胞凋亡的机制尚需进一步的研究。 参考文献 1. Prasad KN, Cole WC, Kumar B,et al. Pros and cons of antioxidant use during radiation therapy J. Cancer Treat R
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