1、Toll 样受体介导的抗病毒天然免疫【关键词】 Toll 样受体 天然免疫 信号转导病毒能否在细胞内生存和复制取决于宿主的抗病毒机制。天然免疫（Innate immunity）作为机体抗感染免疫的第一道防线,主要在获得性免疫(Adaptive immunity)活化前, 发挥抗感染作用。天然免疫系统的细胞可表达模式识别受体（pattern recognition receptors, PRR）, 以识别病原体的结构成分（或称病原体相关分子模式, pathogenassociated molecular patterns, PAMP） 。Toll 样受体（Tolllike receptors,
2、TLR）就是一类 PRR。目前, 已发现的人类TLR 家族成员有 11 种, 其中识别病毒的有: TLR2、 TLR3、 TLR4、 TLR7、 TLR8 和 TLR9, 它们如同天然免疫的“眼睛”, 监视与识别 PAMP, 启动细胞内信号转导通路, 诱导特异性基因表达, 分泌细胞因子/趋化因子, 发挥抗病毒作用。以 TLR 为靶位, 抑制或激活 TLR 表达或调控 TLR 信号通路, 不仅是炎性疾病新的治疗策略, 而且还可作为药物设计和疫苗研制的新靶点。现就TLR 对病毒的识别及信号转导途径作一简要综述。1 TLR 的分子特征迄今, 在人类已发现的 TLR 家族成员有 11 种, 它们在细胞
3、内均有一定的分布。TLR1、 2、 4、 5、 6 表达于细胞表面, TLR3、 7、 8、 9 存在于细胞的胞内体（endosome） 。在首次遇到抗原的细胞, 如巨噬细胞、 中性粒细胞、 树突状细胞均可高水平表达多种 TLR。然而, TLR 的表达并不局限于这些细胞。在大多数细胞和组织中, 虽然 TLR 的表达种类和水平有限, 但体内的大多数细胞似乎至少能表达一种 TLR。TLR 家族的每个成员都有类似的结构特征, 它们均属 I 型跨膜蛋白, 由胞外区（550-980 个氨基酸） 、 跨膜段和胞内区（约 130 个氨基酸）3 部分组成。胞外区富含亮氨酸重复序列（LRR）, 能识别病原体成分
4、; 胞内区有一个Toll/IL1R （TIR）区域,是高度保守的蛋白质相互作用区, 通过与转接分子的相互作用转导信号。TIR 是 Toll 样蛋白和 IL1R 向下游进行信号转导的核心元件, 这一区域关键位点突变或序列缺失将阻断信号向下传递。通过对果蝇、 爬行动物、 鸟类和哺乳动物 DNA 序列比较分析, 发现 TIR 基因具有很高的保守性,而胞外 LRR 结构域的同源性却较低。2 TLR 对病毒的识别TLR 对病原体成分的识别有明确的“分工”: TLR1/TLR2 异二聚体识别三酰基脂肽; TLR2/TLR6 异二聚体识别二酰基脂肽; TLR4 识别细菌脂多糖(LPS)和病毒包膜糖蛋白; T
5、LR3 感受双链 RNA 分子（dsRNA）; TLR5 识别来自鞭毛虫的鞭毛蛋白（Flagellin）; TLR7/8 是单链 RNA（ssRNA）的识别受体; TLR9 的配体是含未甲基化CpG 基序的 DNA; TLR11 感受引起膀胱和肾脏感染的细菌。对病毒而言, 识别 PAMP 的 TLR 有: TLR2、 TLR3、 TLR4、 TLR7、 TLR8 和 TLR9。2.1 TLR9 对含 CpG DNA 基序病毒的识别未甲基化的 CpG 二核苷酸（CpG DNA）的免疫刺激特性首先在细菌DNA 中发现。细菌 DNA 在体外能诱导 B 细胞增殖, 而脊椎动物 DNA 不能。合成的含
6、CpG 基序的寡脱氧核糖核酸(OND), 可以模拟细菌 CpG DNA 产生刺激效应, 如细胞因子的产生、 B 细胞增殖和 DC 成熟等, 但 TLR9 缺陷型小鼠这些反应均消失, 表明 TLR9 是识别 CpG DNA 的受体1。单纯疱疹病毒1 （herpes simplex virus 1, HSV1 ） 、 HSV2 、 小鼠巨细胞病毒（murine cytomegalovirus, MCMV） 、 人巨细胞病毒（HCMV）和腺病毒（Adenovirus）, 因其基因组富含 CpG DNA 基序, 可通过 TLR9 活化炎症细胞因子和 IFN 的分泌, 并发现 TLR9 介导的对HSV1
7、 、HSV2 和 MCMV 应答的 IFN 分泌是 MyD88 依赖的方式。类浆细胞 DC（pDC)是介导 TLR9 依赖性应答的关键细胞。当 TLR9 活化时, pDC产生大量 IFN 。同时发现, TLR9 缺陷型小鼠与对照小鼠相比, 具有较高的病毒滴度和死亡率2, 3。提示 TLR9 在抗 DNA 病毒的免疫应答中具有重要作用, 但其作用机制仍不十分清楚。2.2 TLR7/TLR8 对单链 RNA 病毒的识别 在识别核酸的 TLR 家族成员中, TLR7/8 具有很高的相似程度, 它们参与单链 RNA（ssRNA）病毒的识别4。然而, ssRNA 的哪些区域是TLR7/8 结合与活化所必
8、需的？ 仍处于争论之中。尤其是, TLR7 和（或）TLR8 是否识别特异性基序还未达成共识。游离的鸟苷和尿苷的混合物似乎能通过 TLR7 或 TLR8 充分活化人 PBMC5, 而富集的 GU 或合成的多聚 U RNA 寡核苷能充分活化小鼠 TLR74, 6。Diebold 等6进一步描述了需要 U 残基的特征, 并发现在 ssRNA 内 U 残基的频率和间隔可影响 RNA序列的刺激能力。因此, TLR7 和 TLR8 可能识别不同来源的 RNA, 在介导区分病毒 RNA 和自身 RNA 中起重要作用。TLR7 和 TLR8 均被类似的 ssRNA 配体活化, 它们对病毒识别的相对作用很难区
9、分。TLR7 缺陷型小鼠的研究证实, 该受体对几个单链 RNA 病毒的识别是必需的, 如甲型流感病毒（influenza A virus） 、 水泡性口膜炎病毒（vesicular stomatitis virus, VSV） 。TLR8 在小鼠中的特殊作用还未证实, 但 TLR7 缺陷型小鼠的表型证明, TLR7 和 TLR8 在病毒识别中起非重复的作用。TLR8 是否为识别一群特殊的病毒所必需？ 尚不清楚。TLR7 和 TLR8 的作用在小鼠和人似乎不同。Jurk 等7观察到, 与人 TLR8 相比, 小鼠 TLR8 对合成的 R848 配体没有应答。这一发现提示小鼠 TLR8 与人 TL
10、R8 没有相同的特异性。其原因可能是由于它们遇到的病毒类型不同, 这种特异性发生了进化。2.3 TLR3 对双链 RNA 病毒的识别 TLR3 是识别双链 RNA(dsRNA)的受体。dsRNA 类似物 poly(IC)因其具有免疫刺激能力而引起人们的极大关注。TLR3 缺陷型小鼠的分析证实, 该受体在对 poly(IC)的应答中具有重要作用。不同于其他 TLR, TLR3 活化诱导低水平炎症细胞因子分泌, 但能诱导很强的 IFN 分泌和共刺激分子的表达。因此, TLR3 的活化及其随后 IFN/ 的分泌有助于建立局部的抗病毒状态, 限制病毒在感染部位的复制。Schulz 等8证实 TLR3
11、能识别脑炎心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus）和塞姆利基森林病毒（semliki forest virus）感染期间产生的 dsRNA。这 2 种病毒均属单股正链 RNA 病毒, 仅在病毒复制期间产生 dsRNA。该发现扩大了 TLR3 对病毒识别的范围, 但在病毒感染期间 dsRNA 被识别的精确特性仍不清楚。2.4 TLR4/TLR2 对包膜病毒的识别 病毒包膜糖蛋白是另一类被 TLR 识别的对象。病毒糖蛋白在病毒与其受体结合或进入细胞中起重要作用。因此, 病毒在感染的早期阶段通过糖蛋白与细胞表面的 TLR 接触而被探测, 不需要病毒基因的表达和（或）复制。呼
12、吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus, RSV）以 TLR4 和 CD14 依赖的方式诱导 NFB 活化和炎症细胞因子的分泌9。RSV 的融合蛋白（F）被认为是活化 TLR4 的病毒成分。研究表明, TLR4 缺陷型小鼠与野生型相比, 表现出低水平自然杀伤细胞和 CD14+细胞以及低水平的血清 IL1210, 其生理结果是病毒清除率下降。小鼠乳腺瘤病毒（mouse mammary tumor virus, MMTV）也能活化 TLR4。Rassa 等11发现 MMTV 包膜蛋白(Env)与 TLR4 免疫共沉淀, 该研究提供了 TLR 和病毒蛋白之间相互作用的证
13、据。Burzyn 等12研究显示, MMTV 活化树突状细胞表面的 TLR4 可提高它的入胞受体 CD71的表达, 提示 MMTV 活化 TLR4 有利于病毒进入。该研究也表明 MMTV 还可活化 TLR2。麻疹病毒（measles virus, MV）通过它的血凝蛋白活化 TLR2, 诱导 NFB 和炎症细胞因子分泌。与野生型病毒相比, 组织培养的疫苗株不能刺激 TLR2。提示疫苗株比野生型株更能触发先天性免疫应答。出现这一矛盾的原因可能是人单核细胞当 TLR2 活化时, 野生型 MV 的受体CD150 被上调, 而疫苗 MV 株则利用 CD46 作为入胞受体13。Compton 等14证实
14、, 人巨细胞病毒（HCMV）能以 TLR2 依赖的方式活化 NFB, 诱导炎症细胞因子的分泌。与副黏病毒（Paramyxovirus）和逆转录病毒（Retroviruses）相比, HCMV 结构非常复杂, 它至少有 12 种包膜糖蛋白, 其中可溶性的包膜糖蛋白 B（gB）能活化 NFB 和 IRF3, 诱导IFN 分泌, 使细胞处于抗病毒状态15, 16。同时还发现, 可溶性gB 以 TLR2 依赖的方式也可诱导炎症细胞因子的分泌。但抗 HCMV 应答的诱导是否是 TLR2 介导的过程尚不清楚, 迄今也没有发现 TLR2 与 IFN 途径活化之间的联系。3 TLR 介导的抗病毒免疫信号转导每
15、种 TLR 皆可通过独特而又重叠的信号传导途径转导它的信号17, 18。目前, 关于 TLRs 信号通路和所涉及的信号分子很多, 具体作用机制尚不完全清楚。由 TLR 介导的信号转导通路诱导很多快速反应基因的活化, 产生许多效应分子, 如一氧化氮合成酶、 抗菌肽、炎症细胞因子、 MHC、 共刺激分子和趋化因子, 参与机体防御反应。所有 TLR 和IL1R 受体家族成员均依赖于 TIR 结构域向细胞内转导其识别的信号, 最终活化 NFB 和 IFN 调节因子3 （IRF3 ）, 诱导靶基因表达。其共有的信号通路有 4 种必需成分: (1)髓样分化因子88 （myeloid differentia
16、tion factor88, MyD88）; (2)TRIF（TIR domaincontaining adaptor inducing IFN ）或 TICAM1 （TIR domaincontaining adaptor molecule1 ） ; (3)IL1 受体相关蛋白激酶(IL1Rassiocated kinase, IRAK); (4)肿瘤坏死因子受体相关因子6tumor necrosis factor receptorassociated factor6, TRAF6) 。TLR 被 PAMP 活化后, 导致特异性转接蛋白 MyD88 募集至 TLR的胞内区, 与 IRAK 结
17、合。然后, TRAF6 被募集并与 IRAK 相互作用, 导致下游 NFB 诱导激酶（NIK）和 IB 激酶（IKK）活化。IKK 介导NFB 抑制剂（IB）的磷酸化, 导致 IB 降解, 使 NFB 发生细胞核移位和丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase, MAPK）活化。被NFB 上调的基因主要包括促炎症细胞因子（如 TNF 、 IL1 、 IL6 、 IL8 ）和各种黏附分子。大多数 TLR 通过这条途径转导信号（MyD88 途径） 。然而, TLR3 或 TLR4 与 PAMP 相互作用, 招募另一转接蛋白 TRIF, 使 IRF3 和（或）
18、NFB 活化。TRIF 途径除了增强促炎症细胞因子的分泌外, 还可介导 IFN/ 的分泌、共刺激分子的表达以及树突状细胞的成熟。其中, TLR4 还招募 TRAM（TRIF 相关转接分子）和TIRAPTIR 相关蛋白, 也称 MyD88 转接蛋白样分子（Mal）, 这 2 种分子能分别与 TRIF 和 MyD88 相互作用, 转导信号。可见, TLR 识别配体后, 能募集多种转接分子（如 MyD88, TIRAP, TRIF, TRAM）, 通过 MyD88 途径和 TRIF 途径转导信号。4 结语近年 TLR 在病毒感染和宿主免疫中的作用已受到人们的广泛关注。TLR 分子和功能特征的鉴定,
19、不仅使我们对天然免疫系统的认识达到一个新的水平, 而且也为感染性疾病、 炎症性或自身免疫病的治疗提供了新的思路。病原体成分通过相应的 TLR 识别, 启动细胞内信号转导通路, 诱导特异基因的表达, 如 IFN 、 RANTES、 TNF 、 IL6 、 IL12, 这是 TLR 活化最重要的效应。然而, 许多问题尚有待进一步阐明。迄今, 仅发现部分包膜病毒受 TLR 介导的天然免疫的监视, 其他包膜病毒和非包膜病毒是否被 TLR 识别尚不清楚。病毒展示 PAMP 的分子分析是理解 TLR 识别病毒的分子基础。一些病毒只有进入细胞后, 才能被PRR 识别, 因此在 TLR 活化与病毒入胞同步的情
20、况下, 需进一步了解病毒入胞（如结合和融合）如何与 PRR 天然感知（innate sensing）协调？ 病毒入胞受体及其与包膜糖蛋白的相互作用是否有助于或增强 TLR 活化？TLR 活化如何调节和促进宿主免疫？ 病毒的致病性、 毒力和 TLR 对病毒应答的关系是什么？ TLR 应答如何影响病毒持续和潜伏过程？ 对上述问题的深入研究将阐明病原体与宿主之间的平衡并可能为机体抗感染免疫的分子机制及疾病的发病机制研究提供新的思路, 也将为新型疫苗和免疫调节剂的研发提供新的理论依据。【参考文献】1 Hemmi H, Takeuchi O, Kawai K, et al. Toll like rece
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