1、TWEAK 诱导类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞合成 MMP 3 的实验研究作者：夏丽萍, 肖卫国*, 李俊松, 丁爽, 鲁静【摘要】 目的: 通过观察 TWEAK 在不同浓度下对 RA FLS 诱导合成 MMP3 的影响, 探讨 TWEAK 参与类风湿关节炎(RA)关节骨及软骨破坏的相关机制, 进而寻求治疗 RA 的新途径。方法: 将 rhTWEAK 与成纤维样滑膜细胞（FLS）共培养, 应用 ELISA 法检测细胞培养液中 MMP3 水平; 用反转录 聚合酶反应（RTPCR ）检测 FLS 中 MMP3 mRNA 的表达水平。结果: TWEAK 终浓度为 50、 100 g/L 组诱导 RA
2、FLS 合成 MMP3 的水平明显高于对照组, 具有显著的统计学意义（P0.05）; TWEAK 终浓度为 100 g/L 诱导 RA FLS 的 MMP3 mRNA 表达水平为对照组的 1.26倍, 具有显著的统计学意义（P0.05）; TNF 和 IL1 对TWEAK 诱导 RA FLS 合成 MMP3 及 MMP3 mRNA 表达具有协同作用, 协同作用组 MMP3 的水平及 MMP3mRNA 表达水平明显高于单纯 TWEAK 组, 具有显著的统计学意义（P0.05） 。结论: TWEAK 通过诱导 RA FLS 合成 MMP3, 直接参与 RA 的关节损伤, TNF 和 IL1 在此过
3、程中发挥协同作用。 【关键词】 关节炎; 类风湿; TWEAK; 成纤维样滑膜细胞 ; 基质金属蛋白酶 3 Abstract AIM: To investigate the effects of TWEAK on the synthesis of MMP3 in RA FLS at different concentrations and to discuss the relative mechanism of how TWEAK involves in the destruction of articular bone and cartilage. METHODS: RA FLS were
4、primarily cultured and stimulated with TWEAK. ELISA was used to detect the concentration of MMP3 in cellcultured fluid. The gene mRNA expression of MMP3 was measured by RTPCR. RESULTS: The level of MMP3 induced by TWEAK at 50 and 100 g/L was higher than that in control group, which had significant s
5、tatistic difference（P0.05）.The expression level of MMP3mRNA induced by TWEAK at 100 g/L was 1.26 times higher than that in the control group, which had significant statistic difference（P0.05）.TNF and IL1 had synergetic effect on the synthesis and mRNA expression of MMP3. The level in the synergetic
6、group was significantly higher than that in the simple TWEAK group , which had significant statistic difference（P0.05）. CONCLUSION: TWEAK can induce RA FLS to synthesize MMP3 and damage the articular bone and cartilage directly. TNF, IL1 and TWEAK had synergetic effects during the synthesis of MMP3
7、in RA FLS.Keywordsarthritis; rheumatoid; TWEAK; fibroblastslike synoviocyte; Matrix metalloproteinases 3类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）是一种以关节组织慢性炎症性病变为主要表现的自身免疫性疾病, 其病因及发病机制尚未完全明确。但大量研究证实: 成纤维样滑膜细胞(fibroblastlike synoviocytes, FLS)在 RA 发病过程中处于异常活跃状态, 分泌大量促炎性细胞因子 、 趋化因子和金属蛋白酶, 引发滑膜炎症反应、 软骨基质的崩解1 。肿瘤
8、坏死因子样凋亡的微弱诱导剂 (tumor necrosis factorlike weak inducer of apoptosis, TWEAK)是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)配体超家族的新成员, 具有促进多种细胞因子分泌、 诱导内皮细胞增生和血管生成等作用2, 在 RA 的发生、发展中所起的核心作用备受关注3 。本研究旨在通过观察 TWEAK 在不同浓度下对 RA FLS 诱导合成 MMP3 的影响, 探讨 TWEAK 参与 RA 关节骨及软骨破坏的相关机制, 进而寻求治疗 RA 的新途径。1 材料和方法1.1 材料 滑膜组织取材于中国医科大学附属第
9、一医院骨科, 经关节镜行膝关节置换或滑膜切除术的患者, 诊断均符合 1987 年美国风湿病学会（ARA）修订的类风湿关节炎的分类标准。FITC 鼠抗人 CD14 单克隆抗体（mAb）及其同型阴性对照 mAb 购自深圳晶美公司。FITC 鼠抗人 CD68 mAb 及其同型阴性对照 mAb 购自 Serotec 公司。鼠抗人波形纤维蛋白（Vimentin）mAb 购自 Sigma 公司。免疫组化试剂盒购自 Zymed 公司。重组人 TWEAK、 TNF 、 IL1 购自 Peprotech 公司。MMP3ELISA试剂盒购自 RD 公司。RTPCR 试剂盒购自大连宝生物 TaKaRa 公司。1.2
10、 方法1.2.1 FLS 的分离、 鉴定、 培养 无菌获取关节镜术切除的 RA患者滑膜组织, 尽量剔除脂肪及纤维组织, 无菌 PBS 冲洗 23 遍, 反复剪切成细小组织块, 置于无菌培养皿中, 加入 2 g/L 的胶原酶 37消化 24 h, 200 目纱网过滤后, 离心, 去除脂肪及杂质, 加入含 100 mL/L小牛血清(含青霉素、 链霉素)的 DMEM, 分装于培养瓶内, 置于 37 50 mL/L CO2 孵箱内培养 24 h 后, 更换培养液, 待滑膜细胞 80汇合成片, 按 13 的比例消化传代, 实验用 37 代细胞。FLS 的鉴定采用流式细胞术测定 CD14、 CD68, 免
11、疫组化法测定 vimentin 蛋白。CD14、 CD68均阴性, vimentin 蛋白免疫组化染色呈阳性, 证实所分离的细胞为成纤维样滑膜细胞。1.2.2 细胞因子刺激实验 取处于对数生长期的 FLS, 经 2.5 g/L 胰蛋白酶消化后, 反复吹吸成单细胞悬液, 调整细胞密度为 2108 cell/L, 接种于 6 孔细胞培养板, 37贴壁培养 24 h 后, 弃掉培养液, 用 10 mL/L FCSDMEM 培养液同步化培养 24 h 后, 分别加入 TWEAK（0、 1、 5、 50、 100 g/L）各 3 孔, 其中 2 孔分别加入 TNF(1 g/L）或 IL1(0.1 g/L
12、）, 37 50 mL/L CO2 孵箱内持续培养72 h 后, 收集细胞培养液和细胞, 并向收集的细胞中加入 1 mL TRIzol, 置-20备用。1.2.3 MMP3 浓度检测 采用双抗夹心 ELISA 法检测细胞培养液中 MMP3 的浓度, 按试剂盒提供的说明操作。试剂盒既可测 proMMP3, 又可测活化状态的 MMP3 。以所测标准品 A 值作为纵坐标, 标准品浓度为横坐标, 绘制标准曲线。根据细胞培养液样品的 A 值在标准曲线上查出其浓度。1.2.4 RNA 的提取 取加入 TRIzol 1 mL 冻存的 FLS, 经 0.2 mL氯仿处理后离心, 上清用异丙醇沉淀, 750 m
13、L/L 乙醇洗涤沉淀物, 弃乙醇, 室温干燥后将沉淀溶于适量 DEPC 水中, 核酸紫外分析仪检测, 计算RNA 纯度与浓度, -70冰箱保存。1.2.5 反转录 聚合酶链反应（RTPCR ） cDNA 合成采用反转录试剂盒, 总体积为 10 L: RNA 模板 1 L, 25 mmol/L MgCl2 2 L, 10RT Buffer 1 L, 10 mmol/L dNTP 1 L, 反转录酶 0.5 L, RNase Inhibitor 0.25 L, Random 9 mers 0.5 L, RNase Free dH2O 3.75 L。反应条件: 30 10 min, 42 30 mi
14、n, 99 5 min, 5 5 min。-20 冰箱冻存以备 PCR 用。1.2.6 PCR 扩增 MMP3 引物（上游） 5ATGAAGAGTCTTCCAATCCTACTGT3, （下游）5CATTATATCAGCCTCTCCTTCATAC3, 扩增产物 488 bp; actin引物（上游） 5AAATCGTGCGTGACATTAA3, （下游）5CTCGTCATACTCCTGCTTG3, 扩增产物 472 bp。反应总体积为 50 L , 其中 5PCR Buffer 10 L, 10 mmol/L 上游及下游引物 1 L, Taq DNA 聚合酶 0.25 L, cDNA 模板 10
15、 L, 加双蒸水至总体积 50 L。退火温度为 58。1.2.7 PCR 反应产物分析 取 10 L 扩增产物在含 0.5 mmol/L溴化乙啶的 20 g/L 琼脂糖凝胶中电泳, 凝胶自动成像分析系统扫描成像, 以电泳条带的密度值作为条带的强度指标, 目的基因与内参照的条带密度比值表示 mRNA 的相对表达量, 对表达产物进行半定量分析。1.2.8 统计学分析 检测的数据输入 SPSS10.0 分析软件, 计量资料用 xs 表示, 多样本均数比较采用单因素方差分析, 两两比较采用t 检验, P0.05 表示差异有统计学意义。2 结果2.1 TWEAK 对 RA FLS 诱导合成 MMP3 的
16、影响 TWEAK 诱导 RA FLS 合成 MMP3 的水平如表 1 所示, 显著高于对照组并呈明显的剂量依赖性, 与空白对照组比具有显著的统计学意义（P0.05）; TNF和 IL1 对 TWEAK 诱导 RA FLS 合成 MMP3 具有协同作用, 单纯 TWEAK组与协同作用组比较, 协同作用组 MMP3 的水平明显高于单纯 TWEAK 组, 具有显著的统计学意义（P0.05）; TNF 与 IL1 对 TWEAK 诱导 RA FLS 合成 MMP3 的协同作用, 无统计学意义（P0.05） 。表 1 细胞培养液中 MMP3 的水平（略）Tab 1 The level of MMP3 i
17、n cell culture mediumaP0.05 vs blank group; cP0.05 vs TWEAK group in same concentration.2.2 TWEAK 对 RA FLS 诱导 MMP3mRNA 表达的影响 TWEAK 诱导RA FLS 的 MMP3 mRNA 表达如图 1 所示, TWEAK 终浓度为 100 g/L 实验组的 MMP3 mRNA 表达水平高于对照组, 具有显著的统计学意义（P0.05）; TNF 和 IL1 对 TWEAK 诱导 RA FLS 的 MMP3 mRNA 表达具有协同作用, 单纯 TWEAK 组与协同作用组比较, 协同作
18、用组MMP3 mRNA 表达明显高于单纯 TWEAK 组, 具有显著的统计学意义（P0.05）; TNF 与 IL1 对 TWEAK 诱导 RA FLS 的 MMP3 mRNA 表达的协同作用, 无统计学意义。图 1 TWEAK 诱导 RA FLS MMP3mRNA 表达（略）Fig 1 TWEAK induce RA FLS MMP3mRNA expressionM: DNA marker; 1: FLS+FCSDMEM; 2: FLS+TWEAK(100 g/L); 3: FLS+TWEAK(100 g/L)TNF (1 g/L); 4: FLS+TWEAK(100 g/L)+IL1(0.
19、1 g/L).3 讨论RA 是以滑膜炎症为特征的慢性自身免疫性疾病, 滑膜细胞增生和向周围组织中侵袭、 基质的破坏和降解在 RA 的发病、 慢性炎症的维持和骨与软骨破坏方面有重要作用4 。近来研究发现2, TWEAK 在体外实验中能够诱导 FLS 产生 RANTES、 IP10 、 IL8 、 PGE2 和 IL6, 并且在转录因子水平诱导 IL6 、 IL1 、 IL8 、 IL15 、 IL17表达。另外, 动物实验表明: 应用 mAb 拮抗 TWEAK 的作用后, 能够显著减轻 CIA 鼠关节的炎症反应及滑膜血管增生, 抑制一系列致关节炎症介质的分泌, 包括 RANTES、 IP10 、
20、 MIP1 、 IL6 5 。Perper 等6研究发现, 单纯阻断 TNF 或 TWEAK 的作用, 只能减轻而不能完全阻断 CIA 鼠关节炎症的进展, 推测 TWEAK 与 TNF 在 CIA 鼠关节炎的发生中各自发挥作用并相互协同促进炎症进展。这些研究结果提示, TWEAK 可能是另一个与 TNF 功能相似的, 在关节炎症和组织损伤过程中处于上游调控的细胞因子。本实验着重研究 TWEAK 参与关节骨和软骨破坏的作用机制, 进而证实 TWEAK 在 RA 发病及进展中的核心地位, 为 RA的治疗提供新的方向。以往研究证实7, RA 过程中关节骨和软骨基质的降解与细胞因子刺激下的软骨和滑膜细
21、胞产生 MMP3 有关。MMP3 对 RA 的关节破坏作用至少包括 2 条途径: 首先为直接降解软骨和骨质。其次 , MMP3 在血管生成方面具有重要的作用, 而后者是 RA 的显著特征。血管生成时, 微血管基底膜和间质成分被降解。本研究发现, 外源性TWEAK 能够诱导 FLS 合成 MMP3, 上调 MMP3 mRNA 的表达水平, 并且TWEAK 的诱导作用呈明显的剂量依赖性。因而, 我们推测 TWEAK 可能通过诱导 FLS 合成 MMP3, 直接参与关节骨及软骨的破坏。实验中我们还发现, TNF 和 IL1 能够显著增强 TWEAK 的诱导作用, 提示 TWEAK 可能与 TNF 和
22、 IL1 共同作用诱导 FLS 合成 MMP3, 进而参与关节骨及软骨的破坏。TWEAK 诱导 FLS 合成 MMPs 的具体机制尚不完全清楚, 考虑是与其受体结合, 激活下游的信号转导分子而发挥作用8 。至于TWEAK 诱导 FLS 合成 MMP3 的过程中激活了哪些信号转导分子, TNF 和 IL1 协同 TWEAK 诱导 FLS 合成 MMP3 的相关机制, 尚需进一步的实验研究。因此, 我们推测 TWEAK 作为一种新的致关节炎的介质, 能够刺激 FLS 合成 MMP3 直接损伤关节骨和软骨, 导致 RA 的发生和发展, 阻断 TWEAK 的作用可能成为 RA 治疗的新策略9 。【参考
23、文献】1 Huber LC, Distler O, Tarner I, et al. Synovial fibroblasts; keyplayers in rheumatoid arthritisJ. Rheumatology (Oxford), 2006, 45(6): 669-675.2 Chicheportiche Y, Chicheportiche R, Sizing I, et al. Proinflammatory activity of TWEAK on human dermal fibroblasts and synoviocytes: blocking and enhanc
24、ing effects of antiTWEAK monoclonal antibodiesJ. Arthritis Res, 2002, 4(2): 126-133.3 Kamijo S, Nakajima A, Kamata K, et al. Involvement of TWEAK/Fn14 interaction in the synovial inflammation of RAJ. Rheumatology (Oxford), 2008, 47(4): 442-450.4 Rannou F, Franois M, Corvol MT, et al. Cartilage break
25、down in rheumatoid arthritisJ. Joint Bone Spine, 2006, 73(1): 29-36.5 Kamata K, Kamijo S, Nakajima A, et al. Involvement of TNFlike weak inducer of apoptosis in the pathogenesis of collageninduced arthritisJ. J Immunol, 2006, 177(9): 6433-6439.6 Perper SJ, Browning B, Burkly LC, et al. TWEAK is a no
26、vel arthritogenic mediatorJ. J Immunol, 2006, 177(4): 2610-2620.7 Nanki T. Molecular mechanisms of bone destruction in rheumatoid arthritisJ. Clin Calcium, 2007, 17(4): 510-516.8 Han S, Yoon K, Lee K, et al. TNFrelated weak inducer of apoptosis receptor, a TNF receptor superfamily member, activates NFkappa B through TNF receptorassociated factorsJ. Biochem Biophys Res Commun, 2003, 305(4): 789-796.9 Yepes M, Winkles JA. Inhibition of TWEAK activity as a new treatment for inflammatory and degenerative diseasesJ. Drug News Perspect, 2006 , 19(10): 589-595.
