1、Wnt 信号传导通路在塞来昔布抗结肠癌生长中的作用作者：赵士彭 蔡建辉 赵发 徐德龙 卞红磊 张燕 桂林 【摘要】 目的 研究 Wnt信号传导通路在塞来昔布抗结肠癌生长中的作用。方法 将人结肠癌 HT29 细胞注射于裸鼠背部皮下建立移植瘤模型，16 d后，将裸鼠随机分为对照组、低、中和高剂量塞来昔布组（25、50 和 100 mgkg-1d-1） ，对照组灌胃给予灭菌蒸馏水，各塞来昔布组给予相应剂量的塞来昔布。给药 35 d后，以免疫组织化学方法检测瘤组织 COX2 蛋白表达，以 TUNEL方法检测细胞凋亡，以 Western印迹方法检测凋亡抑制蛋白生存素（survivin）和 连接素（cat
2、enin ）蛋白的表达。结果 低、中和高剂量塞来昔布组的抑瘤率分别为 34.94%、39.20%和 59.20%，与对照组比较，塞来昔布各组移植瘤体积明显缩小(P0.05)，各组 COX2 、survivin 和 catenin 蛋白表达水平均明显降低（均 P0.05） 。塞来昔布对肿瘤生长、细胞凋亡、COX2 和 survivin表达的影响程度随用药剂量的增加而增强。结论 不同剂量的塞来昔布均能明显抑制结肠癌移植瘤的生长，其抑制作用呈明显的剂量依赖性，这种作用是通过 COX2 依赖或非依赖途径对 Wnt信号通路的抑制来诱导细胞凋亡实现的。低剂量塞来昔布是临床治疗的较好选择。 【关键词】 结肠
3、癌；环氧化酶2 抑制剂；survivin； 连接素；细胞凋亡【Abstract】 Objective To study the effect of Wnt signal pathway on celecoxib against colon cancer.Methods Human colon cancer HT29 cells were injected into the BALB/c nude mice back subcutaneously to establish transplantable tumor model.After 16 days，mice were randomly di
4、vided into control group and，low，middle and high dose celecoxib groups (25,50 and 100 mgkg-1d-1).Mice were given sterilized distilled water and different doses of celecoxib in control and different celecoxib groups respectively.The expression of COX2 protein was measured by immunohistochemistry meth
5、od，apoptotic cell was detected by TUNEL，and apoptosis inhibition protein survivin and catenin protein were examined by Western blot in carcinomic tissue.Results The inhibition rate of low，middle and high dose of celecoxib was 34.94%，39.20% and 59.20% respectively.Compared with control group，the volu
6、mes of transplantable tumor of three dose of celecoxib groups were all small(all P0.05),and the expressions of COX2 ，survivin,and catenin were low (all P0.05).The effect of celecoxib on tumor growth，cell apoptosis，and the expressions of COX2 and survivin turned large with the increasing of dose.Conc
7、lusions Celecoxib can suppress tumour growth in different dose and the inhibition effect has obvious dosedependence ，which come true by inhibiting Wnt signal pathway dependent or independent on COX2 and inducing cell apoptosis.Low doses of celecoxib is a better choice for the clinical treatment.【Key
8、 words】 Colon cancer；COX2 inhibitor；Survivin；catenin ；Cell apoptosis非甾体抗炎药(NSAIDs)和昔布类选择性环氧化酶2(COX2) 抑制剂可抑制 COX2 的活性，使人类患结肠癌的危险性下降 40%50%1 。目前对 COX2 抑制剂抗结肠癌生长的作用机制未完全明确。Wnt 信号传导通路中的多个成员在结肠癌癌变过程中出现异常改变2 ，研究认为COX2 抑制剂舒林酸可通过抑制 Wnt通路诱导肝癌细胞凋亡3 ，并可抑制结肠癌细胞抗凋亡蛋白生存素(survivin)的表达。COX2 在瘤组织中的表达与 Wnt信号传导通路中的关键因
9、子 连接素(catenin) 存在相关性。但 COX2 抑制剂在体内如何影响 Wnt信号传导通路中的信号传递未见报道。本实验通过建立人结肠癌裸鼠皮下移植瘤模型，以不同剂量选择性 COX2 抑制剂塞来昔布对裸鼠结肠癌模型分组进行干预治疗,研究塞来昔布对人结肠癌裸鼠移植瘤生长、细胞凋亡及 Wnt信号通路中凋亡抑制蛋白 survivin和 catenin 表达的影响。1 材料与方法1.1 细胞培养及裸鼠皮下移植瘤模型的建立1.1.1 实验动物 45 周龄 BALB/c雌性裸小鼠 40只，体重2024 g（中国医学科学院北京动物研究所） ，实验动物合格证编号：SCXK20050013 。于无特定病原体
10、环境饲养。1.1.2 细胞培养 小牛血清（杭州四季青公司） ；胰蛋白酶和一次性培养瓶（美国 Hyclon公司） ；人结肠癌细胞株 HT29 和 D/F12培养基（中国协和医科大学基础医学院基础医学细胞中心） 。使用含 10%新生牛血清、 100 U/ml青霉素和 100 U/ml链霉素的 D/F12培养基，培养HT29 细胞于 37含 5%CO2培养箱中，适时消化传代。1.1.3 模型建立及分组干预治疗 处于对数生长期的 HT29 细胞，以 0.25%的胰酶、0.02%EDTA 液进行消化，以血细胞计数板进行计数后用不含血清的 D/F12培养基稀释，细胞密度为 1.25107/ml，每只裸鼠皮
11、肤消毒后以 1 ml注射器分别于颈背部皮下注射 0.2 m1细胞悬液，接种细胞 2106/只。定期观察小鼠精神、饮食及排便等情况，游标卡尺测量肿瘤结节的长径(a)、短径(b)，按公式 V=ab2/2，估算肿瘤近似体积。待移植瘤平均直径约 5 mm后(细胞种植后第 16天)，将裸鼠随机分为对照组、塞来昔布低、中和高剂量组（25、50 和 100 mgkg-1d-1） ，每组 10只。塞来昔布（辉瑞制药有限公司）采用灌胃给药，对照组灌胃给予灭菌蒸馏水。给药 35 d后，测量肿瘤体积，计算抑瘤率，处死动物留取肿瘤组织，部分置于 4%多聚甲醛溶液中固定，常规包埋切片。部分置于液氮中冻存备用。1.2 免
12、疫组化检测 COX2 表达 采用 SP法，石蜡切片常规脱蜡至水，抗原热修复，分别滴加一抗和二抗，DAB 显色，苏木精复染。光学显微镜下观察并拍照。COX2 阳性产物为棕黄色颗粒，位于细胞胞质中，细胞胞浆及胞核周围呈黄色者判为阳性。先在低倍镜下对组织切片全面观察，随后于 200倍光镜下，随机观察 10个高倍视野，以北航真彩色病理图像分析系统计算平均积分光密度值。1.3 Western印迹法检测结肠组织 survivin和 catenin 蛋白 取待测组织 100 mg，加入组织裂解液 1 ml，匀浆。取上清液测定蛋白浓度。取 80 g 蛋白加入缓冲液，煮沸变性 5 min，迅速低温冷却后行琼脂糖
13、凝胶电泳。将靶蛋白从凝胶转移至 PVDF膜，PVDF 膜冲洗后加入配好的封闭液，4过夜。封闭好的 PVDF膜加入一抗（1200） ，4过夜。洗涤过的 PVDF膜加入二抗应用液（12 000） ，室温避光缓慢摇动60 min。取出 PVDF膜洗 3次，DAB 显色。照像并观察结果。1.4 TUNEL染色检测移植瘤细胞凋亡指数 TUNEL染色，按试剂盒(Promega Biotech Co.，Ltd)说明进行，二氨基联苯胺显色后封片。镜下观察染色切片，以细胞核染成棕黑色者为凋亡细胞,在 400倍视野下随机选取 5个癌细胞区，计数细胞总数和凋亡细胞数，计算 TUNEL染色阳性细胞的百分率，即为凋亡指
14、数(AI):AI=凋亡细胞数/癌细胞总数100%。1.5 统计学处理 所有数据以 xs表示，应用 SAS6.12统计学软件进行 ANOVA方差分析。2 结 果2.1 成瘤及裸鼠一般情况 40只裸鼠均成瘤，成瘤率 100%，成瘤时间为细胞种植后第 511 天。肿瘤细胞种植后第 16天，肿瘤直径平均达 5 mm。成瘤后早期裸鼠的体重，活动情况没有明显改变，随着肿瘤形成并逐渐增大，裸鼠逐渐出现消瘦，活动减少。在实验后期，塞来昔布高剂量组裸鼠活动明显减少，精神状态差，2 只裸鼠死亡。实验结束切取瘤组织后，对裸鼠解剖，各组均未发现移植瘤肝转移。2.2 塞来昔布对移植瘤生长的影响 给药前各组裸鼠移植瘤体积
15、之间无显著差异（P0.05） ；低、中和高剂量塞来昔布均能明显抑制人结肠癌裸鼠移植瘤的生长，其抑瘤率分别为 34.94%，39.20%和 59.20%，均较对照组移植瘤生长缓慢（均 P0.05） ，且高剂量组较低剂量组的移植瘤生长缓慢（P0.05） ，其余各组间抑瘤率无明显差异，见表 1。表 1 各组裸鼠移植瘤体积比较2.3 塞来昔布对移植瘤 COX2 表达的影响 与对照组比较，塞来昔布各组 COX2 表达水平均明显降低（均 P0.05） ；高剂量塞来昔布组表达水平较低剂量组明显降低（P0.05） ，而中剂量组与低、高剂量组间无显著差异 (P0.05)，见表 2。2.4 塞来昔布对移植瘤 su
16、rvivin和 catenin 蛋白表达的影响 与对照组相比，塞来昔布各组 survivin蛋白表达水平均明显降低（均 P0.05） ，其中高剂量塞来昔布较低剂量组表达更低（P0.05） ，而中剂量组与高、低剂量组间无显著差异（均 P0.05） 。塞来昔布各组catenin 蛋白表达均低于对照组（均 P0.05） ，而塞来昔布各组间的蛋白表达均无差异（P0.05） ，见表 2、图 1。2.5 塞来昔布对移植瘤细胞凋亡的影响 与对照组比较，塞来昔布各组肿瘤组织细胞凋亡明显增加（均 P0.05） 。高剂量塞来昔布组移植瘤细胞凋亡较低、中剂量塞来昔布组明显增高（均 P0.05） ，见表2，图 2。表
17、 2 各组裸鼠移植瘤 COX2 、survivin、catenin 的表达和细胞凋亡比较 图 2 TUNEL染色检测各组移植瘤细胞凋亡（200）3 讨 论结直肠癌的发生和发展是一种多途径的复杂过程，塞来昔布或其他 COX2 抑制剂将 COX2 作为结直肠癌或其他肿瘤治疗的一个新的靶点展示了良好的前景，但其临床应用最佳剂量，应用的安全性和有效性等因素限制了其临床应用。越来越多的证据显示 COX2 抑制剂可抑制体外肿瘤细胞和移植瘤的生长并呈剂量依赖性。任亮等4研究塞来昔布对裸鼠膀胱癌（T24 细胞系）皮下移植瘤的生长，抑瘤率达 83.7%。在本实验中，我们发现低剂量塞来昔布组裸鼠移植瘤生长明显减慢
18、，随给药剂量的增加，抑瘤率增加，高剂量组移植瘤体积较低剂量组明显缩小。在实验后期，高剂量塞来昔布组裸鼠的活动减少、精神萎靡提示高剂量塞来昔布产生了明显的副作用，其中 2只裸鼠死亡考虑与用药剂量过大有关，但实验结束时各组裸鼠的体重无明显差别。Wnt信号传导通路是一种既可影响基因表达又可影响细胞迁徙的信号通路，catenin 是该通路的重要信号传递子，其在胞质内的稳定、积累及进核是 Wnt信号传递的重要步骤。catenin/TCF4 的结合在核内共同调控靶基因的表达，如 cmyc ，cyclin D1等。survivin 也是此通路的下一个靶点，是凋亡抑制蛋白家族成员之一，可以在绝大多数肿瘤组织表
19、达，在正常组织中则不表达,是提示预后不良的因素之一。在一项肺癌研究中认为 COX2 与 survivin的表达有协同上升趋势，COX2 的持续高表达使 survivin表达的稳定性增加，导致促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白失衡，细胞凋亡减少5 。Zhang6等关于舒林酸对结肠癌细胞的作用研究中也认为舒林酸可抑制结肠癌细胞抗凋亡蛋白survivin的表达。其他研究也支持 COX2 与 survivin表达的相关性。Kawasaki等7研究 catenin 和 COX2 过表达的关系，认为胞浆catenin 和 COX2 的过表达存在相关性，胞浆 catenin 在稳定COX2 mRNA表达方面起到了作用。
20、也有研究认为 COX2 作为 APC的一个修饰基因位点对 catenin 的表达发挥着重要的作用8 。在本实验中，给予裸鼠低剂量塞来昔布可使移植瘤组织 COX2 、catenin和 survivin表达同时下降。因此认为塞来昔布通过抑制 Wnt信号的传导而抑制了肿瘤的生长。COX2 和 survivin蛋白表达下降程度呈明显剂量依赖性，而塞来昔布对 catenin 基因表达的抑制作用未随剂量的增加而加强，提示 COX2 抑制剂塞来昔布可能亦通过非 COX2 依赖途径影响 catenin 表达。因此，塞来昔布可能通过 COX2 依赖和非依赖途径同时影响 Wnt信号的传导。本实验中塞来昔布在低剂量
21、时即可明显影响 Wnt信号传导通路中catenin 和 survivin的表达，从而抑制下游靶基因表达，促进细胞凋亡，抑制肿瘤生长，而剂量增至 50 mgkg1d-1 时肿瘤体积并未明显缩小，细胞凋亡指数和对 Wnt信号的影响未见增加，随剂量增至 100 mgkg-1d-1时，其抗肿瘤效应增加，但副作用也相应增加，并造成 2只裸鼠死亡，因此低剂量塞来昔布是临床的较好选择。【参考文献】1 DuBois RN.Review article：cyclooxygenasea target for colon cancer preventionJ.Aliment Pharmacol Ther,2000;
22、14 （Suppl 1）:647.2 王 蓉，邓明高，杨国嵘，等.Survivin、MMP9 在大肠腺瘤癌变过程中的表达及其意义J.中国老年学杂志，2007;27（5）：45861.3 冯晓铖，王晓明，张 毅，等.Sulindac 通过抑制 Wnt通路诱导SMMC7721 肝癌细胞凋亡J.复旦学报(医学版)，2007;34（4）:5226.4 任 亮，侯树坤，王晓峰，等.塞来昔布对膀胱癌裸鼠皮下移植瘤及移植瘤细胞凋亡的影响J.中华泌尿外科杂志，2006;27（4）：302.5 Krysan K，Merchant FH，Zhu L,et al.COX2dependent stabilizatio
23、n of survivin in nonsmall cell lung cancerJ.FASEB J，2004;18(1):2068.6 Zhang T，Fields JZ，Ehrlich SM,et al.The chemopreventive agent sulindac attenuates expression of the antiapoptotic protein survivin in colorectal carcinoma cellsJ.J Pharmacol Exp Ther,2004;308(2):4347.7 Kawasaki T，Nosho K，Ohnishi M,et al.Correlation of betacatenin localization with cyclooxygenase2 expression and CpG island methylator phenotype (CIMP) in colorectal cancerJ.Neoplasia,2007;9(7):56977.8 张志宏，韩盛玺.RNA 干扰 Survivin基因治疗大肠癌作用机制的研究进展J.世界华人消化杂志，2006;14(33):32158.
