1、阿托伐他汀对醛固酮诱导心脏成纤维细胞内皮素表达的影响作者：武宇洲，崔炜，李淑琴，张雷，鲁静朝，张冀东，都军 【摘要】 目的： 研究阿托伐他汀对醛固酮诱导大鼠心脏成纤维细胞（CFs）内皮素（ET）表达的影响. 方法： 以培养的新生 SD 大鼠 CFs为实验模型，放免法检测 CFs 培养液中 ET 水平，流式细胞术测定 CFs 中的 ET1 含量，RTPCR 测定内皮素1 前体（ppET1 ）mRNA 的表达. 结果： 醛固酮（110-7 mol/L）组 CFs 培养液中 ET 水平和 CFs 中的ET1 含量及 ppET1 mRNA 的表达明显高于正常对照组，差异有统计学意义(P0.01)；醛固
2、酮（110-7 mol/L）+阿托伐他汀（110-6, 110-5, 110-4 mol/L）组明显低于醛固酮（110-7 mol/L）组，差异有统计学意义（P0.01） ；醛固酮（110-7 mol/L）+阿托伐他汀（110-4 mol/L）+甲羟戊酸（110-3 mol/L）组明显高于醛固酮（110-7 mol/L）+阿托伐他汀（110-4 mol/L）组，差异有统计学意义(P0.01)，但和醛固酮（110-7 mol/L）组接近，差异无统计学意义(P0.05). 结论： 阿托伐他汀可抑制醛固酮诱导的 CFs ppET1 mRNA 表达以及 ET1 的合成和分泌，其机制可能与甲羟戊酸代谢途
3、径有关. 【关键词】 醛固酮；内皮缩血管肽类；阿托伐他汀；心脏；成纤维细胞 0 引言 他汀类药物是胆固醇合成限速酶的抑制剂，近年来大量资料提示，此类药物除有调脂作用外，还有非调脂作用，在减轻心脏重塑中发挥着重要的作用. 我们以往的实验1发现心脏成纤维细胞（cardiac fibroblasts, CFs）可分泌内皮素（endothelin, ET） ，与心肌纤维化的发生、发展密切相关，推测阿托伐他汀有可能通过调节 ET 的表达参与了抗心肌纤维化过程. 因此，本实验旨在观察阿托伐他汀对醛固酮诱导新生 SD 大鼠 CFs 内皮素1 前体（preproendothelin1, ppET1 ）mRNA
4、表达以及 ET1 的合成和分泌的影响. 1 材料和方法 1.1 材料 出生 13 d 的 SD 大鼠 15 只（河北医科大学动物中心）. 醛固酮、甲羟戊酸、胰蛋白酶、牛血清白蛋白（Sigma 公司） ；DMEM/F12 培养基和胎牛血清（美国 Gibco 公司） ；ET1 多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司） ；纤维连接蛋白 mAb（Santa Cruz 公司）. RT 试剂、PCR 试剂和 DNA Marker（大连 TaKaRa 公司） ；内皮素放免试剂盒（解放军总医院科技开发中心放免所）. 阿托伐他汀（北京嘉林药业股份有限公司）. 1.2 方法 1.2.1 CFs 的培养和鉴定 取
5、13 d 龄 SD 大鼠在无菌条件下开胸剪取心室，用胰蛋白酶消化法和差速贴壁法获得 CFs2. 在 50 mL/L CO2，37培养箱中孵育，待 CFs 生长接近融合时以 13 传代，实验采用已传 24 代的 CFs，SABC法免疫组织化学染色，纤维连接蛋白染色阳性鉴定为所需的 CFs. 1.2.2 实验分组 将 CFs (2105 细胞/cm2)接种于 24 孔培养板和 25 cm2 的玻璃培养瓶中，待细胞生长至亚融合状态时，以 10 g/L 牛血清白蛋白培养液培养预适应 24 h 后，根据实验分组要求换用加入各种处理因素的 10 g/L 牛血清白蛋白培养液继续培养. 实验分组为正常对照组，
6、醛固酮(110-7 mol/L)组，醛固酮(110-7 mol/L)+阿托伐他汀(110-6，110-5，110-4 mol/L)组和醛固酮(110-7 mol/L)+阿托伐他汀(110-4 mol/L) +甲羟戊酸(110-3 mol/L)组. 1.2.3 CFs 培养液中 ET 的水平应用放射免疫分析法，按照试剂盒说明书操作，测定 CFs 培养液中的 ET 水平. 1.2.4 CFs 中 ET1 的含量用胰蛋白酶EDTA 消化、收集细胞，固定于 4 ，700 mL/L 乙醇中. 应用流式细胞术3 ，采用 EpicsXL型流式细胞仪和 Expo 32 ADC 进行免疫荧光数据分析. 1.2.
7、5 CFs ET1 mRNA 的表达 提取细胞总 RNA，进行逆转录反应. PpET1 引物4(上游5AAC CAT GGA TTA TTT GCT CAT G3, 下游 5AGT GTT GAC CCA AAT GAT GTC3) 和 GAPDH 引物5(上游 5AAT GCA TCC TGC ACC AA3, 下游 5GTA GCC ATA TTC ATT GTC ATA3) 由北京塞百盛基因技术有限公司合成，可扩增出长度为 230 bp 的 ppET1 cDNA片段和 515 bp 的 GAPDH cDNA 片段. PCR 反应条件：ppET1 ：94变性45 s，54退火 45 s，7
8、2延伸 60 s；GAPDH：94变性 45 s，48退火 45 s，72延伸 90 s，32 个循环. PCR 产物于含 GV 核酸染料的琼脂糖凝胶电泳，用 BIOPROFIF 凝胶图像分析系统进行分析. 所有实验均重复 3 次. 统计学处理： 数据以 xs 表示，应用 SPSS13.0 统计软件对资料进行分析，多组均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSDt 检验. P0.05 为差异有统计学意义. 2 结果 2.1 阿托伐他汀和甲羟戊酸对醛固酮诱导的 CFs 培养液中 ET 水平的影响醛固酮（110-7 mol/L）作用 48 h，CFs 培养液中 ET 水平较正常对照组明显升高，
9、差异有统计学意义(P0.01，表 1)；分别给予阿托伐他汀（110-6, 110-5, 110-4 mol/L）预处理 CFs 24 h 后，再加入醛固酮（110-7 mol/L）作用 48 h，CFs 培养液中 ET 水平呈递减趋势，与醛固酮组相比均明显降低，差异有统计学意义(P0.01)；其中阿托伐他汀（110-4 mol/L）组和正常对照组接近，差异无统计学意义(P0.05) ；甲羟戊酸（110-3 mol/L）和阿托伐他汀（110-4 mol/L）共同预处理 CFs 后，CFs 培养液中 ET 水平明显高于阿托伐他汀（110-4 mol/L）组，差异有统计学意义(P0.01)，但和醛固
10、酮组接近，差异无统计学意义(P0.05). 表 1 不同条件下 CFs ppET1 mRNA 表达，ET1 合成和分泌(略) 2.2 阿托伐他汀和甲羟戊酸对醛固酮诱导的 CFs 中 ET1 含量的影响醛固酮（110-7 mol/L）作用 24 h，CFs 中 ET1 含量明显高于正常对照组，差异有统计学意义(P0.01，表 1)；分别给予阿托伐他汀（110-6, 110-5, 110-4 mol/L）预处理 CFs 24 h 后，再加入醛固酮（110-7 mol/L）作用 24 h，CFs 中 ET1 含量呈递减趋势，与醛固酮组相比均明显降低，差异有统计学意义(P0.01)；其中阿托伐他汀（1
11、10-4 mol/L）组和正常对照组接近，差异无统计学意义(P0.05) ；甲羟戊酸（110-3 mol/L）和阿托伐他汀（110-4 mol/L）共同预处理 CFs 后，CFs 中 ET1 含量明显高于阿托伐他汀（110-4 mol/L）组，差异有统计学意义(P0.01)，但和醛固酮组接近，差异无统计学意义(P0.05，图 1）. 2.3 阿托伐他汀和甲羟戊酸对醛固酮诱导的 CFs ppET1 mRNA 表达的影响醛固酮（110-7 mol/L）作用 4 h，CFs ppET1 mRNA 的表达明显高于正常对照组，差异有统计学意义(P0.01，表 1)；分别给予阿托伐他汀（110-6, 11
12、0-5, 110-4 mol/L）预处理 CFs 24 h 后，再加入醛固酮（110-7 mol/L）作用 4 h，CFs ppET1 mRNA 的表达呈递减趋势，与醛固酮组相比均明显降低，差异有统计学意义(P0.01)；其中阿托伐他汀（110-4 mol/L）组和正常对照组接近，差异无统计学意义(P0.05) ；甲羟戊酸（110-3 mol/L）和阿托伐他汀（110-4 mol/L）共同预处理 CFs 后，CFs ppET1 mRNA 的表达明显高于阿托伐他汀（110-4 mol/L）组，差异有统计学意义(P0.01)，但和醛固酮组接近，差异无统计学意义(P0.05，图 2）. 3 讨论 E
13、T1 在心脏局部及全身循环中起重要作用6. 近年来发现 CFs能合成 ET1 并与心脏肥厚和心肌纤维化的发生、发展密切相关. CFs 占心脏容积的 0.25 和心脏细胞总数的 0.7，有证据表明 CFs 可能是心肌纤维化的主要效应细胞，也是他汀类药物的主要靶细胞7-8. 同时有研究9发现，他汀类药物在抗心脏重塑的过程中伴有心肌 ppET1 mRNA和 ET1 水平的下降. 另外，一项临床研究10显示阿托伐他汀治疗可降低心力衰竭患者血浆 ET1 水平. 因此，推测阿托伐他汀可能是通过调节 ET1 的表达参与抗心肌纤维化过程的. 我们的结果显示，醛固酮能明显诱导 CFs ppET1 mRNA 表达
14、、ET1 的合成和释放，同时阿托伐他汀可显著抑制醛固酮的上述作用，表明阿托伐他汀减轻心肌纤维化的作用可能是通过其下调 ET1 水平介导的. 他汀类药物的主要作用机制是通过竞争性抑制 HMGCoA 还原酶，在肝脏抑制胆固醇的合成，同时也阻断了甲羟戊酸和这一通路上其他重要的类异戊二烯中间体的生成11 ，抑制 Ras 和 Rho 等小分子 GTP 结合蛋白的类异戊二烯化修饰，导致胞质内非活性的小 G 蛋白堆积，阻断细胞内信号转导，从而具有多效性，即不仅具有调脂作用，还具有许多非调脂作用, 其所带来的临床益处已远远超过其调脂作用. 与此相一致的是，最近一些临床和动物实验研究发现他汀类药物可抑制心脏成纤
15、维细胞增殖和胶原合成7-8 ，并且这种作用与甲羟戊酸代谢途径有关. 我们的结果发现，阿托伐他汀抑制醛固酮诱导 CFs ppET1 mRNA 表达、以及ET1 合成和释放的作用可被外源性甲羟戊酸拮抗，也进一步支持甲羟戊酸途径可能参与了阿托伐他汀的非调脂作用. 另外，有研究11表明，他汀类药物并不改变 ET1 转录的稳定性，提示阿托伐他汀减少 ET1合成和释放的作用可能是通过抑制 ppET1 mRNA 表达实现的. 我们从细胞、分子和 mRNA 水平观察到阿托伐他汀通过甲羟戊酸途径抑制醛固酮诱导的 CFs ppET1 mRNA 表达、以及 ET1 的合成和释放. 鉴于 ET1 与心肌纤维化的发生、
16、发展密切相关，进一步支持他汀类药物可能通过甲羟戊酸途径抑制 ET1 表达，减轻心肌纤维化. 【参考文献】 1冯惠清，崔炜，冯惠平，等. 醛固酮对新生大鼠心肌成纤维细胞分泌 ET, NO 功能的影响J. 中国应用生理学杂志, 2005, 21(1): 78-80. 2杨竞霄，赵连友，郑强荪，等. 尾加压素对乳鼠心肌成纤维细胞增殖的影响及细胞内信号转导机制J. 第四军医大学学报, 2004, 25(6): 519-522. 3Sun XC, Li WB, Li QJ, et al. Limb ischemic preconditioning induces brain ischemic toler
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